咖啡對糖尿病大鼠胰島素敏感性、氧化應(yīng)激指標(biāo)及胰腺內(nèi)胰島素含量的影響

糖尿病嚴(yán)重威脅人類健康，飲食習(xí)慣和生活方式與糖代謝紊亂的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。最近國外多中心的流行病學(xué)研究顯示,長期飲用咖啡能降低2型糖尿病的發(fā)病率,而且發(fā)病率與每日飲用咖啡的量呈負(fù)相關(guān)。本研究分別以咖啡和去咖啡因咖啡灌胃大鼠后,觀察高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠糖調(diào)節(jié)狀態(tài)和血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)及胰腺內(nèi)胰島素含量,評估咖啡對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)和胰島素敏感性和內(nèi)源性胰島素分泌的影響。1材料表面1.1實驗動物及其飼養(yǎng)條件清潔級健康雄性Wistar大鼠48只,平均體重215g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,合格證號:SCXK(滬)2008/0016,在室溫為18~25℃,相對濕度50%~80%條件下飼養(yǎng)。1.2灌胃用具體糖與咖啡成分的關(guān)系高脂飼料(熱量百分比:18%豬油、8%蛋黃粉、2%膽固醇、0.2%膽鹽和71.8%普通基礎(chǔ)飼料,上海斯萊克實驗動物有限公司);STZ(美國Sigma公司,純度:99.89%);灌胃用含咖啡因咖啡和去咖啡因速溶咖啡(云南云潞食品公司,經(jīng)高效液相質(zhì)譜分析檢測,含咖啡因咖啡咖啡因含量26mg·g-1,去咖啡因咖啡咖啡因含量<1mg·g-1);胰腺內(nèi)胰島素含量以放射免疫法檢測,雙抗體夾心ELISA法測血漿8-OHDG和血漿8-isoPGF2α水平,以上放射性免疫試劑盒及ELISA試劑盒均購自上海杰飛生物科技有限公司。2方法2.1各組的分組。對于有機(jī)溶劑不同的組織,每模型組有7個月隨機(jī)取12只Wistar大鼠為正常對照組(NC組),其余36只分為3組,每組12只,各為咖啡灌胃組(CC組)、去咖啡因咖啡灌胃組(DC組)、STZ對照組(S組)。2.2gd-1的處理NC組予以常規(guī)飼養(yǎng),CC組、DC組、S組予高脂飼料,4組大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。CC組予含咖啡因咖啡0.5g·d-1,DC組予去咖啡因速溶咖啡0.5g·d-1,以6mL生理鹽水溶解,每日灌胃2次。S組以同等量生理鹽水每日灌胃2次。大鼠連續(xù)灌胃8周,隔夜空腹>10h,CC組、DC組、S組大鼠予以STZ10mg·kg-1腹腔注射(STZ以pH=4.4的0.1mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋)。2.3空腹血糖及灌胃后20、60、126min大鼠STZ腹腔注射后1周,予隔夜禁食>10h,稱重,行OGTT,葡萄糖2.2g·kg-1溶于4mL蒸餾水灌胃,記錄大鼠空腹血糖及灌胃后30、60、120min血糖。行OGTT后第2日,再次予隔夜禁食10h,稱重,行ITT,頸后皮下注射胰島素(諾和林R,丹麥諾和諾德公司)0.5U/(kg·只),即刻予葡萄糖2.2g·kg-1,記錄胰島素注射后15、30、60、120min血糖值,計算各時間點血糖相對于注射前血糖下降比率Δ%[(胰島素注射前血糖-ITT觀察點血糖值)/注射前血糖)]。2.4胰腺內(nèi)胰島素水平大鼠腹腔注射2%戊巴比妥麻醉,腹主動脈取血,2500r·min-1離心10min,分離血漿,雙抗體夾心法ELISA測血漿8-OHDG和血漿8-isoPGF2α水平。酸乙醇提取法提取胰腺內(nèi)胰島素,取大鼠胰腺組織,-70℃液氮速凍,溶解于pH2.5~3.0的0.4%草酸和70%乙醇混合液中。溫度10~15℃下攪拌提取。離心后再次以酸乙醇液提取,合并2次浸出液。放射免疫法檢測胰腺內(nèi)免疫反應(yīng)性胰島素(IRI)含量。2.5間均數(shù)的比較所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)比較采用方差分析。各組間均數(shù)兩兩比較采用S-N-K檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以胰腺內(nèi)胰島素水平為應(yīng)變量,ITT血糖下降比例、8-OHDG、8-isoPGF2α進(jìn)入多元回歸,分析以上指標(biāo)與胰腺內(nèi)胰島素的相關(guān)性。3結(jié)果3.14高脂飲食聯(lián)合小劑量stz誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型評價結(jié)果OGTT結(jié)果顯示,CC組、DC組和S組大鼠空腹血糖及OGTT30、60、120min血糖均明顯高于NC組大鼠(P<0.05),說明高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型成功(見表1)。3.24cc組與dc組2種外包劑2、10、100min%與S組比較,DC組和CC組ITT30、60、120min血糖下降比例(Δ%)明顯增加,與NC組比較,CC組和DC組30、60、120minΔ%無顯著差異。提示糖尿病大鼠較正常對照大鼠存在外周胰島素利用障礙,咖啡和去咖啡因咖啡灌胃均有可能提高本實驗中糖尿病大鼠外源性胰島素利用(見表2)。3.34cc對8-isopgf2和8-ohdg水平的影響CC組、DC組、S組血漿8-isoPGF2α和8-OHDG水平均較NC組明顯升高,CC組和DC組8-isoPGF2α和8-OHDG水平顯著低于S組。CC組和DC組間比較無顯著差異。該結(jié)果提示糖尿病大鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯高于正常對照組,但咖啡和去咖啡因咖啡咖啡灌胃均有可能改善糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài),兩者對體內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物影響無明顯差異(見表3)。3.44咖啡灌胃對糖尿病大鼠胰腺內(nèi)源性胰島素水平的影響與NC組比較,CC組、DC組、S組胰腺內(nèi)平均胰島素含量顯著降低,CC組平均胰腺內(nèi)胰島素水平明顯高于DC組和S組,提示本實驗中糖尿病大鼠內(nèi)源性胰島素分泌不足,咖啡灌胃可增加糖尿病大鼠胰腺內(nèi)胰島素分泌,而去咖啡因咖啡則無此作用(見表3)。3.5相關(guān)分析相關(guān)分析顯示胰腺內(nèi)胰島素含量與血漿8-isoPGF2α顯著負(fù)相關(guān)(B=-2.036,P=0.007)。4高血壓大鼠糖尿病外源性胰島素利用機(jī)制近年來,糖尿病患者的飲食結(jié)構(gòu)日益受到關(guān)注,越來越多醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注于如何調(diào)節(jié)患者日常飲食以控制血糖同時避免膳食過度單一化?？Х仁悄壳叭蛳牧孔畲蟮膩碓从谔烊恢参锏娘嬃稀＜韧?jīng)認(rèn)為咖啡中主要成分咖啡因可刺激垂體-腎上腺皮質(zhì)軸,引起促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇合成增加、降低胰島素的敏感性,因而建議糖尿病易感人群應(yīng)盡量減少富含咖啡因飲料的攝入。然而,對1.6萬名芬蘭人進(jìn)行長期的跟蹤發(fā)現(xiàn)每日喝咖啡3~4杯的女性,糖尿病發(fā)病率降低29%;每日喝咖啡>10杯的女性,糖尿病發(fā)病率降低79%。在男性中,這2個數(shù)字分別為27%和55%。該結(jié)果被列入美國《時代》周刊2006年醫(yī)學(xué)新發(fā)現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計,目前全球共有10余項多中心臨床研究和2項meta分析支持長期適量飲用咖啡可降低2型糖尿病的發(fā)生風(fēng)險,且咖啡降低糖尿病發(fā)生率趨勢無關(guān)種族、人群、和地區(qū)分布。目前,關(guān)于咖啡調(diào)節(jié)糖代謝機(jī)制的實驗室研究進(jìn)行較少,長期飲用咖啡降低2型糖尿病發(fā)生的具體機(jī)制尚不明確。STZ選擇性破壞胰島B細(xì)胞,大劑量注射可制造接近1型糖尿病動物模型。由于2型糖尿病兼有胰島素抵抗和B細(xì)胞功能障礙特點,本研究以高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ制作糖尿病模型,OGTT各觀察時間點血糖明顯升高,ITT提示機(jī)體胰島素利用障礙和胰島素抵抗,胰腺內(nèi)胰島素含量明顯低于正常對照組,造模過程中未出現(xiàn)動物死亡,說明造模成功,高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ可獲得較穩(wěn)定的合并外周胰島素抵抗的糖尿病大鼠模型。本研究ITT結(jié)果,DC組和CC組30、60、120min血糖下降比例(Δ%)明顯高于S組,且與NC組比較Δ%無顯著差異,提示咖啡和去咖啡因咖啡均可提高糖尿病大鼠外源性胰島素利用。近年臨床研究報道,2型糖尿病發(fā)生率隨日常飲品中咖啡因攝入量而下降,亦有報道長期飲用含咖啡因或去咖啡因咖啡均能顯著降低2型糖尿病的發(fā)生率,提示咖啡中主要成分咖啡因和其他生物活性物質(zhì)都可能參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝,與本研究結(jié)果相符。目前已證實咖啡中氯原酸能減少葡萄糖的吸收、抑制肝糖原的水解、增加胰島素敏感性,葫蘆巴堿和鎂離子有助于增強(qiáng)胰島素的分泌及敏感性。盡管部分研究發(fā)現(xiàn)短期給予較大劑量咖啡因可損害機(jī)體胰島素敏感性,加重胰島素抵抗,但有學(xué)者認(rèn)為,長期飲用咖啡可使得機(jī)體逐漸產(chǎn)生耐受,降低遠(yuǎn)期糖尿病發(fā)生率與飲料中攝入咖啡因量相關(guān)。有研究報道短期給予酚醛類化合物可拮抗咖啡因?qū)μ谴x的短期不利影響,可能與去咖啡因咖啡降低糖尿病發(fā)生率相關(guān)。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是高血糖對胰島B細(xì)胞毒性作用的主要機(jī)制之一。STZ破壞胰島B細(xì)胞主要機(jī)制是通過誘導(dǎo)NO合成增加對B細(xì)胞的氧化侵襲,與糖尿病氧化應(yīng)激損傷B細(xì)胞類似。B細(xì)胞DNA鏈上的堿基鳥嘌呤C-8位受羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊發(fā)生羥化生成8-OHDG,是DNA氧化損傷的特異及主要的產(chǎn)物,亦是公認(rèn)的內(nèi)源及外源性因素對DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物。8-isoPGF2α是具生物活性的擬前列腺素樣物質(zhì),是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物,特異反映組織氧化應(yīng)激水平。本研究結(jié)果顯示CC組、DC組和S組腹腔注射STZ后,血漿8-isoPGF2α和8-OHDG水平較正常對照組明顯升高,提示高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘發(fā)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng),導(dǎo)致氧化損傷。咖啡中咖啡因、酚醛類化合物、類黑素等多種生物活性成分均有抗氧化作用,體外實驗證實咖啡具有較強(qiáng)的抗氧化能力,咖啡中亞麻木脂素組分可通過減少氧化應(yīng)激降低注射STZ的大鼠糖尿病發(fā)生率。本實驗觀察到CC組和DC組注射STZ后血漿8-isoPGF2α和8-OHDG水平低于S組,支持含咖啡因咖啡或去咖啡因咖啡均可影響氧化應(yīng)激,減輕機(jī)體氧化損傷。作為分泌胰島素的主要細(xì)胞,胰島B細(xì)胞分泌胰島素過程與細(xì)胞內(nèi)電興奮有關(guān)?？Х纫蚴羌?xì)胞內(nèi)ryanodine鈣庫受體激動劑,可能通過引發(fā)對ryanodine敏感的鈣庫釋放,促使胰島素分泌。由于本實驗中大鼠ITT需注射外源性胰島素,檢測血清胰島素水平難以準(zhǔn)確評估大鼠自身胰島分泌功能,胰腺內(nèi)胰島素含量測定較外周血胰島素水平更直接準(zhǔn)確反映B細(xì)胞分泌功能。本研究結(jié)果顯示CC組、DC組、S組經(jīng)STZ注射后胰腺內(nèi)胰島素較正常對照組顯著下降,然而,CC組胰腺內(nèi)胰島素含量高于DC組和S組,提示咖啡因可促進(jìn)內(nèi)源性胰島分泌,可能對維持正常B細(xì)胞功能具潛在作用?；貧w分析統(tǒng)計結(jié)果顯示,胰腺內(nèi)胰島素水平與8-isoPGF2α顯著負(fù)相關(guān),提示B細(xì)胞胰島素分泌功能障礙可能是氧化應(yīng)激的直接或間接結(jié)果,減輕機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)有助于B細(xì)胞功能保護(hù)。本研究以高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型,同時以含咖啡因咖啡和去咖啡因咖啡干預(yù),結(jié)果顯示兩者均可能增加胰島素敏感性、