鏈霉菌阿維菌素的分離、純化及生物活性

1975年，日本北理研究所從靜岡區義東市河奈區的土壤樣本中分離出一條鏈霉菌（strepticma-4700）。發現該菌株的發芽液具有很高的抗腸道寄生蟲活性，對哺乳動物的毒性非常低。即使濃度增加了八倍，也不會發現毒性。隨后,美國Merk公司從該菌發酵菌絲中提取出一族結構相似的十六元大環內酯類化合物,并命名為阿維菌素(avermectins,簡稱AVM)。AVM包含有8個結構相似的天然組分,分別編號為A1a、A2a、A1b、A2b、B1a、B2a、B1b和B2b,其中A1a、A2a、B1a、B2a是大量組分,占總含量的80%以上;A1b、A2b、B1b、B2b是少量組分,占總含量的20%以下。B1組分的殺蟲活性最高,商品化的AVM即為B1a(≥80%)與B1b(≤20%)的混合物。1981年,阿維菌素作為獸藥投入市場,1985年作為農藥投入市場。中國從20世紀80年代末開始對阿維菌素的研究,1994年臨時登記了第1個1.8%阿維菌素乳油,1996年登記了第1個阿維菌素原藥,到目前為止,約有30多家企業登記了阿維菌素原藥。阿維菌素是迄今發現的最有效的殺昆蟲劑、殺螨蟲劑和殺寄生蟲劑之一。1阿維菌素的調節作用與其他殺蟲劑不同,阿維菌素既不抑制膽堿酯酶,也不抑制蟲體內蛋白質、核酸等有機物的合成。AVM作用機制最初的解釋為:γ–氨基丁酸(GABA)是線蟲傳出神經系統中的一種神經遞質,當神經沖動到達神經末梢時,神經末梢的細胞膜釋放出GABA,作用于次級神經元細胞膜或效應器細胞膜,產生抑制效應,完成神經沖動的傳遞過程。當AVM進入靶標生物體后,表現為對GABA的激動作用,使神經末梢細胞膜大量釋放GABA,并能促進GABA與次級神經元細胞膜或效應器細胞膜的結合,產生長時間的高強度抑制效應,使線蟲麻痹死亡。但是后來研究發現,當AVM濃度較低時,可引起與GABA系統無關的Cl–通道的開放。大量研究表明,AVM可引起谷氨酸控制的Cl–通道的開放,從而導致膜對Cl–通透性增加,帶負電荷的Cl–會引起神經元休止電位的超極化,使正常的電動電位不能釋放,神經傳導受阻,最終導致蟲體麻痹死亡。阿維菌素對哺乳動物有很強的選擇性。哺乳動物外周神經傳導介質為乙酰膽堿(Ach),以GABA作傳導介質的神經僅存在于中樞神經系統,由于哺乳動物具有血腦屏障,因而藥物進入中樞神經系統的數量很少。此外,至今尚未發現在哺乳動物體內存在受谷氨酸控制的Cl–通道。因此,AVM對哺乳動物具有很高的安全性。2急性毒性藥大鼠毒理學研究表明,阿維菌素無三致作用(致畸、致癌、致突變)。急性毒性試驗結果表明,阿維菌素原藥(阿維菌素B1含量>95%)對大鼠急性經口LD50為10~27mg/kg,按照中國農藥毒性分級標準,屬高毒殺蟲劑,原藥對小鼠急性經口LD50為13mg/kg;兔急性經皮LD50>2000mg/kg,大鼠急性經皮LD50>380mg/kg;大鼠急性吸入雄性LD50為209.12mg/m3,中等毒性,雌性LD50為156.89mg/m3,高毒。對水生生物高毒,鱒魚96hLC50為3.6μg/L,藍鰓翻車魚96hLC50為9.6μg/L。對蜜蜂高毒,經口LD50為0.009g/頭,接觸LD50為0.002g/頭,但殘留在葉面的LT50為4h,4h以后殘留在葉面的藥劑對蜜蜂低毒。對鳥類低毒,鵪鶉急性經口LD50為86.4mg/kg,鴿子為537mg/kg。3關于療效的研究3.1阿維菌素對2齡幼蟲的滲透能力阿維菌素對多種植物線蟲均有較好的控制作用。1.8%阿維菌素乳油對南方根結線蟲具有很強的殺線活性。1.8%阿維菌素乳油質量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625mg/L時,對南方根結線蟲的校正死亡率分別為80.47%、69.51%、58.87%、47.80%和35.13%。藥劑處理24h,阿維菌素對南方根結線蟲的LC50值為1.48mg/L。阿維菌素對南方根結線蟲的毒殺作用隨處理時間延長而增大。阿維菌素處理2齡幼蟲2、24、48h后,LD50分別為63.6051、8.5111和7.3461μg/mL。阿維菌素抑制2齡幼蟲的侵入能力,線蟲侵染率隨藥劑濃度增大而降低。阿維菌素0.5、2μg/mL處理根結線蟲,48h后2齡幼蟲對番茄根部的侵入率分別為8.32%、0.12%,而對照處理線蟲的侵入率為21.85%。阿維菌素(24h)對南方根結線蟲、腎形線蟲的致死中濃度分別為1.56μg/mL和32.9μg/mL,阿維菌素還可降低南方根結線蟲、腎形線蟲對番茄的侵染力。阿維菌素對松材線蟲具較強的殺滅作用,且對松材線蟲的繁殖也有較強的抑制作用。阿維菌素50、500μg/mL處理24h后,線蟲校正死亡率分別為83.05%、95.96%。500μg/mL阿維菌素處理5d后,線蟲繁殖抑制率為100%。阿維菌素與硫酸銅聯合使用對松材線蟲毒性增強。阿維菌素和吡蟲啉聯合染毒,也對松材線蟲表現出增效作用。阿維菌素對甘薯莖線蟲和穿刺短體線蟲均有較好的殺滅效果。阿維菌素400mg/L以下時,河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧4地甘薯莖線蟲的死亡率均在45%以下,但當用量增大到600mg/L時,其死亡率陡增,達到90%以上。阿維菌素不同濃度處理穿刺短體線蟲0.5h后,線蟲校正死亡率隨處理濃度升高而增加,當阿維菌素濃度為200mg/mL時,供試線蟲校正死亡率達到100%。處理濃度不變,延長處理時間可提高穿刺短體線蟲的校正死亡率。3.2阿維菌素防治新疆楊線蟲的效果阿維菌素有種子處理、播前或定植前穴施、生長期灌根、葉面噴施、植株根部注射等多種田間施藥方式。1.8%阿維菌素乳油600mL/hm2播前毒土處理,對黃瓜根結線蟲病的防效為59.38%。阿維菌素播前1mL/m2表面噴施(土壤混合施藥),西瓜根結線蟲病的病情指數、根結數量、根結重/根重分別比對照降低47.04%、48.32%、23.47%。0.5%阿維菌素顆粒劑播前施藥2000、3000、3500g/667m2,對黃瓜根結線蟲病的防效為66.61%~74.63%;定植前穴施3000、3250、3500g/667m2,防效分別為67.1%、72.1%、78.6%。1.8%阿維菌素乳油3000mL/hm2灌根,對不同作物上南方根結線蟲的平均防效為76%~82%。番茄定植30d后,2%阿維菌素1000倍液50mL灌根處理,40d后對根結線蟲的防治效果為66.3%。香蕉莖基部注射阿維菌素,可以有效控制爪哇根結線蟲和香蕉相似穿孔線蟲的侵染。線蟲接種28d或56d后注射施藥,阿維菌素(250、500μg/株)對爪哇根結線蟲和香蕉相似穿孔線蟲均表現出顯著防效。1.2%阿維菌素微膠囊懸浮劑按病樹胸徑每厘米用藥0.08、1.0、1.2mL,60d后對松材線蟲的防治效果分別為73.33%、86.66%、93.33%。阿維菌素不同用藥方式對線蟲防治效果有差異。25%阿維菌素乳油1000倍液灌根,施藥7、15、25d后新疆楊線蟲平均減退率分別為64.5%、60.8%、53.7%;而阿維菌素1500g/hm2土壤處理,防治7、15、25d后,線蟲平均減退率分別為39.6%、22.4%、8.8%。防治新疆楊線蟲,根灌效果好于土壤處理。阿維菌素處理種子,可以減少線蟲對植物的侵染,同時促進植株生長。阿維菌素100g/100kg處理棉花種子,定植35d后,棉花根部根結線蟲卵數為8472,比對照降低73.82%;株高23.1cm,比對照增加22.87%。阿維菌素0.1mg處理種子,玉米短體線蟲和棉花上南方根結線蟲的減退率均達80%以上,0.3mg處理,甜菜異皮線蟲的減退率為60%。1.8%阿維菌素可濕性粉劑5g/100kg拌種大豆種子,大豆苗期根數、株高和單株鮮重分別較對照增加16.25%、18.60%和4.94%;大豆產量增加5.56%。目前,市售阿維菌素有乳油、顆粒劑、可濕性粉劑、粉劑等不同劑型,同一劑型的有效成分含量又有不同。不同含量、不同劑型的阿維菌素處理均可以很好地控制植物線蟲。1.8%阿維菌素乳油15L/m2處理溫室土壤,藥后90d土壤中黃瓜根結線蟲、番茄根結線蟲2齡幼蟲數量減退率分別為10.04%、75.68%,防效分別為46.5%、62.87%;用量20kg/hm2,藥后60、90d對苦瓜根結線蟲的防治效果分別為62.7%、50.5%。2%阿維菌素乳油1000倍液處理播前土壤,藥后45d牛蒡根結線蟲蟲口減退率為68.5%,病情指數下降52.34%。10%阿維菌素顆粒劑3kg/667m2拌土溝施,對黃瓜根結線蟲的防治效果為71.17%。0.26%阿維菌素粉劑2.25、3.0、4.0kg/667m2,藥后20d對花生根結線蟲病的防效分別為54.1%、74.1%、68.2%;藥后45d的防效分別為66.7%、85.2%、81.5%。1.8%阿維菌素乳油用量0.1、0.15、0.2mL,對香蕉穿孔線蟲的防效分別為92.78%、94.35%、96.09%;0.5%阿維菌素顆粒劑用量3、3.5、4g,對香蕉穿孔線蟲的防效分別為98.26%、99.39%、100%。1.8%阿維菌素乳油、0.5%阿維菌素顆粒劑對香蕉穿孔線蟲均表現良好的防治效果,兩者差異不顯著。0.5%阿維菌素顆粒劑45kg/hm2拌沙溝施,能抑制半穿刺線蟲在土壤中和根上的蟲口密度,對土壤中和根上蟲口的平均防效分別為68.65%和65.89%。24.5%阿維菌素乳油2000倍液1800L/hm2淋根,可顯著抑制半穿刺線蟲在土壤中和根上的蟲口密度,對土壤中和根上蟲口的平均防效分別為75.90%和74.39%。阿維菌素對草莓滑刃線蟲的控制效果因寄主植物而異。阿維菌素0.005g/L處理,對侵染紫花野芝麻的草莓滑刃線蟲防效達81.23%以上;用量增大到0.011g/L,仍不能控制侵染比利時杜鵑和秋海棠的草莓滑刃線蟲。阿維菌素對線蟲的防效隨用藥次數增加而增大。阿維菌素不僅能夠很好地控制植物寄生線蟲,并且能夠促進植株生長。阿維菌素對胡椒根結線蟲、榕樹根結線蟲均有較好的防治效果。阿維菌素不同劑量處理均能減少植株根部卵囊、雌蟲數量、根結數及土壤中2齡幼蟲數量。高濃度1.5×10–3處理,油菜株高增長率最高19.1%,莖鮮重增長率中等,為42.6%;中濃度1.0×10–3處理,油菜株高增長率中等,為15.7%,莖鮮重增長率最高,為52.8%。將鱗球莖莖線蟲置于阿維菌素稀釋液中(0.018、0.036、0.072g/L)浸泡4h,50%線蟲失去活動力。將浸泡后線蟲接種大蒜,與對照相比,阿維菌素0.072g/L處理,每平米蒜株數增加3.20%,大蒜橫徑增大,大蒜產量增加12.87%,且線蟲侵染率僅為7%。小麥返青期溝施0.5%阿維菌素顆粒劑30kg/hm2,小麥校正胞囊減退率最大(55.13%),且增產效果好,增產率為18.54%;60kg/hm2處理后小麥株高平均值最大(59.32cm),植株增高明顯。1.8%阿維菌素乳油3000倍液澆窩,對甘薯莖線蟲的防治效果為77.3%,薯塊增產12.9%。1.8%阿維菌素乳油0.99mL/m2,藥后49d栝樓根結線蟲2齡幼蟲蟲口減退率為89.6%;藥后124d,栝樓增果率為250%。阿維菌素作用機制獨特,且具有較長的持效期。香蕉莖基部注射阿維菌素,藥劑在香蕉樹中持效期至少可達56d。香蕉施藥(100μg/株)28d后分別接種爪哇根結線蟲和香蕉相似穿孔線蟲,28d后,阿維菌素對2種線蟲的控制效果仍分別高達100%和84.46%。2%阿維菌素乳油稀釋500倍液灌根,12周后對盆景根圍的植物病原線蟲減退率高達95.2%。2%阿維菌素乳油連續2年在16棵黑松上注干防治松材線蟲,注藥量400mL/m3(60mL/株),第1年對松材線蟲的防效達到100%,第2年為88%,持效期2年。取樣檢查樹體內線蟲,距地面4m處的樹干內沒有發現任何線蟲,說明藥劑被注入樹干的芯材部位后,可擴散到樹體的上部。1.8%阿維菌素乳油40mL/m2拌毒土,藥后45、70d對黃瓜根結線蟲的防效分別為62.9%、13.2%;天線一號(0.5%阿維菌素可濕性粉劑)2.5kg/667m2拌土,藥后45、70d對黃瓜根結線蟲的防效分別為69.6%、77.1%,阿維菌素可濕性粉劑持效期較乳油好。阿維菌素對根結線蟲的防效優于常規殺蟲劑。阿維菌素、噻唑磷、滅線磷、敵敵畏、吡蟲啉、毒死蜱、敵百蟲對根結線蟲的防效分別為35%、27%、20%、20%、20%、20%、13%,1.8%,阿維菌素防治效果最好。將阿維菌素與其他化學藥劑聯合使用可以提高單劑的防治效果。0.2%阿維菌素和3%吡蟲啉、1%阿維菌素和1%苦參堿2個藥劑組合林間注干施藥(施藥劑量2mL/cm胸徑)防治松材線蟲,第1年防治效果均為100%,第2年防效分別為