原發(fā)性舍格倫綜合征患者lr7、8、9表達(dá)及l(fā)r7、9在腮腺組織中的表達(dá)

shjgreen’ssyndrose，簡(jiǎn)稱(chēng)sjsyndrose，是一種自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是外源性腺體的破壞，口腔粘膜和眼睛粘膜干燥，并伴有各種自身免疫性疾病。可分為原發(fā)性舍格倫綜合征(primarySj觟gren’ssyndrome,pSS)和繼發(fā)性SS(secondarySj觟gren’ssyndrome,sSS)。病變局限于淚腺和唾液腺者,稱(chēng)為pSS;同時(shí)伴有其他自身免疫性疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等,則稱(chēng)為繼發(fā)性SS。在自身免疫性疾病中,pSS的發(fā)病率僅次于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,其在正常人群中的發(fā)病率為0.6%,男女之比為1∶9,好發(fā)于中老年女性。與其他自身免疫疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡相比,舍格倫綜合征是一個(gè)進(jìn)展緩慢,預(yù)后較好的疾病。但SS最常見(jiàn)的癥狀口干和眼干嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。類(lèi)似于其他自身免疫性疾病,SS的病因尚不明確。研究認(rèn)為,病毒、激素、遺傳和環(huán)境因素與SS的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)。一些病毒如Epstein-Barr病毒、柯薩奇病毒、丙型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等都被認(rèn)為可能是SS的誘因。小唇腺的基因芯片研究顯示,干擾素誘導(dǎo)基因如Toll-likereceptor(TLR)家族,干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族的3個(gè)成員IFITM1、IFITM2和IFITM3,干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)、干擾素刺激轉(zhuǎn)錄因子3γ(ISGF3G)(也稱(chēng)為IRF9)和干擾素α誘導(dǎo)蛋白27(I-FI27)等在pSS中顯著高表達(dá)。由于TLRs在先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答中都是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子,所以TLR家族成員在免疫科學(xué)領(lǐng)域是一個(gè)研究熱點(diǎn)。TLRs在宿主和病原微生物的接觸面發(fā)揮作用,作為人類(lèi)第一道防御監(jiān)視系統(tǒng),能在第一時(shí)間抵抗病原物的侵襲。TLRs能發(fā)現(xiàn)病原相關(guān)分子模式(PAMPs),而后者是病原體的一類(lèi)保守的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),被激活后即被先天性免疫系統(tǒng)識(shí)別。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了13種TLRs:TLR1~9系人類(lèi)和小鼠共有,TLR10僅在人類(lèi)發(fā)現(xiàn),TLR11~13僅在小鼠發(fā)現(xiàn)。一些TLRs(1、2、4、5和6)存在于細(xì)胞表面,而另一些TLRs(3、7、8和9)局限于細(xì)胞內(nèi)。TLR7和TLR8作為家族中最相似的成員,能識(shí)別病毒的PAMPs,TLR9能被含有非甲基化的CpG二核苷酸的病毒DNA序列激活。所以,TLR7、8和9組成了TLR家族中的一個(gè)功能亞族,它們能在內(nèi)涵體或溶酶體內(nèi)識(shí)別病毒的PAMPs。由于多種病毒被認(rèn)為是pSS發(fā)病的誘因,故本研究通過(guò)使用實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(real-timePCR)分析pSS患者外周血中TLR7、8、9的表達(dá)水平,并對(duì)TLR7和TLR9在pSS患者腮腺組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。1材料和方法1.1pss的診斷研究對(duì)象來(lái)自2006年2月~2006年8月在我院口腔頜面外科涎腺專(zhuān)科門(mén)診就診的病例,共61例。參考2002年歐美診斷標(biāo)準(zhǔn),其中pSS37例,對(duì)照組24例為非pSS的口干患者。pSS具體診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)口干癥狀;(2)眼干癥狀;(3)口干體征———方糖試驗(yàn)30min內(nèi)未融化;(4)眼干體征———施墨試驗(yàn)≤5mm/5min;(5)組織病理學(xué)———唇腺活檢至少有1個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶;(6)血清學(xué)檢查———類(lèi)風(fēng)濕因子、抗SS-A、抗SS-B抗體至少1項(xiàng)陽(yáng)性;(7)無(wú)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等其他自身免疫性疾病。根據(jù)以上診斷標(biāo)準(zhǔn),將61例患者分為pSS組和對(duì)照組。pSS組37例患者以上6項(xiàng)中(5)、(6)均為陽(yáng)性,而其余4項(xiàng)中2項(xiàng)為陽(yáng)性。對(duì)照組24例患者僅有口干癥狀或腮腺腫大癥狀,而無(wú)其他任何診斷為pSS的客觀癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。對(duì)照組包括非pSS口干患者(如老年性口干、服用降血壓、安眠藥后造成的口干等)和慢性腮腺炎患者。pSS組37例,男1例,女36例;年齡21~73歲,平均(47.38±12.27)歲。對(duì)照組24例,男1例,女23例;年齡23~65歲,平均(48.13±11.32)歲。1.2免疫組化測(cè)定GeneAmpPCRSystem9700(美國(guó)ABI公司);GeneAmpPCRSystem2400(美國(guó)ABI公司);核酸蛋白質(zhì)定量系統(tǒng)DV800(美國(guó)BeckmanCoulter公司);ABIPRISM7900HT(美國(guó)ABI公司);人白血病T淋巴(Jurkat)細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所);免疫熒光一抗TLR7:sc-30004是兔抗人的多克隆抗體(SantCruzBiotechnologyCalifornia,美國(guó));免疫熒光二抗sc-2012是Cy3羊抗兔的IgG(SantCruzBiotechnology,California,美國(guó));免疫組化一抗TLR9:sc-16247是兔抗人的多克隆抗體(SantCruzBiotechnology,California,美國(guó));免疫組化二抗HRP-Polymer-Goatanti-rabbitIgG,即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP2,德國(guó))。1.3紅細(xì)胞裂解及體外感官檢測(cè)(1)每位患者采集外周靜脈血2.5mL,以0.5mL枸櫞酸(ACD)抗凝劑(枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、右旋葡萄糖1.47g加蒸餾水至100mL)進(jìn)行抗凝處理;將采集到的血液靜置約30min后,3000r/min離心2min,分離血漿。吸出血漿后,按1︰4~5的比例加入紅細(xì)胞裂解液,用漩渦振蕩器混合均勻,放于4℃環(huán)境下10min,以裂解紅細(xì)胞;2000r/min離心10min,棄上清。按每毫升全血加入1mLRIzolRNA保存液加入保存液,以備RNA抽提。(2)pSS組3例患者,對(duì)照組3例患者因藥物或保守治療無(wú)效,在患者的要求下進(jìn)行腮腺淺葉切除術(shù)(pSS組為類(lèi)腫瘤型SS,對(duì)照組為重度慢性阻塞性腮腺炎)。全麻下取腮腺組織,經(jīng)中性甲醛溶液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,做4μm厚連續(xù)切片,備TLR7免疫熒光和TLR9免疫組化檢測(cè)。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1.4離心穩(wěn)定性檢測(cè)溫育(15℃~30℃)5min,以完全分離核蛋白;加入0.2mL氯仿,劇搖15s,溫育(15℃~30℃)3min,13200r/min、4℃離心15min;將離心后的上層水相吸出,轉(zhuǎn)移到新管中,加入0.5mL異丙醇,混勻,室溫下溫育10min,13200r/min、4℃離心10min后,棄上清;在沉淀中加入1mL焦碳酸二乙酯和75%乙醇,振蕩混勻,9000r/min、4℃離心5min,棄上清;加入30μL無(wú)RNase水,吹打混勻后進(jìn)行微離心;取1μL上述液體,1∶100稀釋,用核酸蛋白質(zhì)定量系統(tǒng)測(cè)該溶液的OD值,以檢驗(yàn)所抽提的RNA質(zhì)量和含量。-70℃冷凍備用。1.4.2pcr反應(yīng)(1)配制PCR試劑混合溶液(2)將Mix1分裝入PCR管中,每管3.5μL,加入經(jīng)過(guò)離心的RNA2.5μL,混勻,離心。用PCR儀在65℃反應(yīng)5min,于冰上快速冷凍。(3)離心后,各管中再加入Mix23.5μL,混勻后離心,42℃反應(yīng)2min。(4)在每管中加入0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶,進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用兩步法,反應(yīng)條件如下:(5)取1mL完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溶液進(jìn)行1∶100稀釋,測(cè)試OD值。1.4.3jurkat細(xì)胞濃度用全培養(yǎng)液(PRMI1640,L-谷氨酰胺,50mmol/LHEPES,100U/mL青、鏈霉素,10%胎牛血清)稀釋Jurkat細(xì)胞濃度為(1~5)×106/mL,37℃,5%CO2條件下孵育,2~3天換液1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,收集計(jì)數(shù)達(dá)1×107/mL。按每106~107個(gè)細(xì)胞/mLTRIzol加入試劑,并按前述方法進(jìn)行總RNA抽提,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。1.4.4引物的設(shè)計(jì)與制作具體步驟如下。(2)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照基因,以PrimerExpress5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增模板的引物。設(shè)計(jì)的引物如下:(4)引物稀釋:引物在稀釋前,需至少離心1min,按說(shuō)明書(shū)計(jì)算,以確定稀釋引物所需要加入蒸餾水的量,配成100μmol/L的儲(chǔ)存濃度,用前配制成10μmol/L的工作濃度。(5)引物檢測(cè):要求引物的溶解曲線為單峰,引物無(wú)二聚體產(chǎn)生。1.4.5ct值的標(biāo)化PCR反應(yīng)結(jié)束后,確定基線范圍(一般為3~15個(gè)循環(huán)),分析各孔CT閾值(閾值=基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10)。為消除每份樣品的濃度不一致與每塊板之間條件操作因素差異所形成的誤差,需要對(duì)所獲得的原始CT值進(jìn)行標(biāo)化。本研究用管家基因GAPDH作為內(nèi)參,1∶32稀釋jurkat細(xì)胞的IRFs表達(dá)量為標(biāo)化樣品,比較各樣本表達(dá)量的高低。以SDS2.1軟件分析其Ct值。-△△Ct值=-[(樣本原始Ct值-樣本GAPDH的Ct值)-(Jurkat原始Ct值-JurkatGAPDH的Ct值)]-△△Ct值越高,表明樣本中IFN-α基因的起始模板量越大。實(shí)時(shí)定量PCR共40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括95℃、10s,95℃、5s和60℃、30s。1.4.6免疫熒光二抗pbs腮腺組織切片與1∶50稀釋的抗TLR7一抗在4℃潮濕環(huán)境下孵育。然后再與免疫熒光二抗在37℃環(huán)境下孵育30min。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。以細(xì)胞上出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性標(biāo)記。1.4.7ntm二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用MaxVisionTM二步法,具體操作參考試劑盒工作手冊(cè)。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照,以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽(yáng)性標(biāo)記。1.5統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SAS6.12軟件包對(duì)血細(xì)胞中的-△△Ct值進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為組間有顯著性差異。2結(jié)果2.1組tlr7mrna表達(dá)量的比較37例pSS組TLR7mRNA的-△△Ct值為6.87±1.29,24例對(duì)照組TLR7mRNA為5.75±1.05(-△△Ct值越高,表明樣本中TLR7基因的起始模板量越大)。pSS組的TLR7mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,2組之間有顯著差異,P=0.0008。pSS組TLR7是對(duì)照組的2.17倍(圖1A、圖2)。2.2組tlr8mrna表達(dá)量的比較37例pSS組TLR8mRNA的-△△Ct值為8.62±1.89,24例對(duì)照組TLR8mRNA為9.18±1.46。2組的TLR8mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異,P=0.223。pSS組TLR8是對(duì)照組的0.68倍(圖1B、圖2)。2.3tlr9mrna表達(dá)量37例pSS組TLR9mRNA的-△△Ct值為7.60±1.69,24例對(duì)照組TLR9mRNA為6.38±1.42。pSS組的TLR9mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,2組之間有顯著差異,P=0.0047。pSS組TLR9是對(duì)照組的2.33倍(圖1C、圖2)。2.4tlr7在腺泡細(xì)胞中的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),pSS組3例患者TLR7陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞位于導(dǎo)管上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和上皮島(圖3A~D)。對(duì)照組3例TLR7陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞局限于導(dǎo)管上皮細(xì)胞,淋巴細(xì)胞為陰性表達(dá)(圖3E)。TLR7在2組腺泡細(xì)胞中的表達(dá)均為陰性。pSS組與對(duì)照組的最大差別是SS組淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)和上皮島陽(yáng)性表達(dá)。由于上皮島是pSS組織病理學(xué)的一個(gè)特征,所以?xún)烧唛g的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。2.5tlr9在腺泡細(xì)胞表達(dá)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),pSS組3例患者TLR9陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞位于導(dǎo)管上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和上皮島(圖4A~D)。對(duì)照組3例TLR9陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞局限于導(dǎo)管上皮細(xì)胞,淋巴細(xì)胞為陰性表達(dá)(圖4E)。TLR9在2組腺泡細(xì)胞中的表達(dá)均為陰性。與TLR7一樣,pSS組與對(duì)照組的最大差別是pSS組淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)和上皮島陽(yáng)性表達(dá)。3tlr3、7,8和9在pss和h-的表達(dá)方面的作用,主要表現(xiàn)為T(mén)LR表達(dá)于多種細(xì)胞,如呼吸道和消化道上皮細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。TLR表達(dá)于多種細(xì)胞,證實(shí)其在先天性和獲得性免疫應(yīng)答中的重要作用。TLR的一個(gè)顯著特征是對(duì)分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和專(zhuān)一性的識(shí)別。研究發(fā)現(xiàn),樹(shù)突狀細(xì)胞在pSS發(fā)病中具有重要作用。通過(guò)TLR受體激活漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞,將先天性免疫和獲得性免疫連接起來(lái),誘導(dǎo)I型IFN(IFN-α/IFN-β)分泌顯著增多。而在血液中,I型干擾素主要來(lái)源于漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞,這類(lèi)細(xì)胞被激活后能產(chǎn)生大量I型干擾素,激發(fā)先天性和獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生。在pSS,血液中的漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量顯著下降,而剩余的漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞仍能被激活,并產(chǎn)生大量的I型干擾素。通過(guò)TLR激活,導(dǎo)致漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IFN-α,主要是由于病毒感染。多種TLRs能識(shí)別病毒的組成部分,包括TLR3、7、8和9。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)TLR7和TLR9,如被TLR7配體、單鏈病毒RNA和一些TLR9的激活物(如DNA病毒和含有磷酸胞苷酰CpG的寡核苷酸)激活,能產(chǎn)生大量的IFN-α。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞分泌大量的IFN-α,而漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞又主要表達(dá)TLR7和9,這從另一方面說(shuō)明TLR7和9的配體是體內(nèi)IFN-α產(chǎn)生的主要誘導(dǎo)劑。各種不同類(lèi)型細(xì)胞在應(yīng)對(duì)外界刺激,包括細(xì)菌、異物、大分子、其他化學(xué)合成物和病毒等時(shí)產(chǎn)生的一類(lèi)蛋白質(zhì),稱(chēng)為干擾素(IFN)。病毒感染在IFN產(chǎn)生的初期起著重要作用,但在組織水平的持續(xù)的IFN-α合成,需要含有RNA的免疫復(fù)合物激活漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞,產(chǎn)生IFN-α。I型IFN能召集其他免疫細(xì)胞,通過(guò)I型干擾素的各種免疫功能維持免疫應(yīng)答。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-α能召集其他活化的細(xì)胞進(jìn)入pSS的目標(biāo)臟器,提示TLR7或TLR9可能在pSS發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用。除識(shí)別病原體外,TLRs也能識(shí)別宿主壞死組織釋放的自身抗原。SS的特征是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)外分泌腺,導(dǎo)致外分泌腺功能受損,臨床表現(xiàn)為口干和干燥性角結(jié)膜炎。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶中的細(xì)胞大多數(shù)是T淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞占20%~30%,巨噬細(xì)胞較少。大約70%的T細(xì)