番木瓜組織培養與環斑病毒病的抗性研究

番木瓜的植株復雜，遺傳高度混合。很難通過傳統的育種方法保持相同的植株性。同時，番木瓜環境病病從多年生持續到一級，極大地限制了番木瓜的生產和利用。通過組織培養進行無性系快速繁殖可以解決,在種苗商業化生產中已進入應用階段。1材料和方法1.1外植體的選擇、檢測和預處理從田間成年健壯番木瓜植株上剪取生長有頂芽和側芽的旺盛分枝,切除多余枝條部分,去掉葉片、葉柄,放入保鮮袋。1.2消毒外植體的決定1.2.1山農政監獄培養的篩選自來水沖洗10min→飽和肥皂水浸泡20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→4%次氯酸鈉12min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農一號溶液的培養基中。1.2.2山農政民間培養基的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞10min→4%次氯酸鈉8min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農一號溶液的培養基中。1.2.3接種水生物膜的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞10min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農一號溶液的培養基中。1.2.4山農政藥種的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→0.1%升汞10min→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農一號溶液的培養基中。1.2.5接種及接種方法自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→0.1%升汞10min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農一號溶液的培養基中。1.2.6接種及接種方法自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農一號溶液的培養基中。1.3培養基誘導培養基:MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L瓊脂。1.4培訓條件培養室溫度25±2℃,光強1500lx,光周期12h,相對濕度60-80%。1.5材料的沖洗和接種供試材料“穗優”細菌污染材料10瓶,每瓶1個外植體。先用無菌水沖洗材料,后用細頭尖鑷剔除粘附在外植體表面的細菌(物理清除),再用25mg/L的硫酸鏈霉素溶液(孔徑0.22μm的濾膜抽濾)浸泡清洗,最后將材料接種至含0.2%山農一號的培養基中。2結果2.1綜合考慮消毒處理效果由表1可知:方法I、Ⅲ有較高的污染率,而Ⅱ與IV、V有較高的失活率;綜合考慮方法Ⅵ消毒處理效果較好,污染率11.11%,成活率77.78%。消毒后頂芽與側芽接種在MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養基上,4-6周后形成小叢芽,沒有明顯的愈傷組織(圖1)。2.2外植體的拯救試驗使用濃度25mg/L、經抽濾滅菌(0.22μm濾孔)的硫酸鏈霉素對10瓶細菌污染外植體(圖1-e)進行搶救,之后接種到含有0.2%“山農一號”的培養基上。試驗結果顯示8株外植體搶救成活,搶救成活率達80%,但對中、重度污染材料無能為力。因此,使用抗生素硫酸鏈霉素和抑菌劑山農一號結合,對輕度細菌污染的珍貴外植體材料搶救十分有效。3硫酸鏈霉素pcr外植體的消毒處理試驗結果表明番木瓜無菌培養體系的建立可用頂芽與側芽為外植體誘導叢芽,消毒方法為:自來水沖洗10min→飽和肥皂水浸泡20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農一號I型溶液的培養基(MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L瓊脂)。硫酸鏈霉素對于污染珍貴材料的搶救有較好的效果。研究發現:可用成年植株主莖上帶頂芽和腋芽的枝條為材料,留用頂端部分做外植體。切除大葉柄,保留苗端和少數小(直徑1-2mm)葉柄。帶有腋芽的小葉柄切除基部后和苗端一起消毒,接種在含有BA與NAA的MS培養基上,葉柄腋部形成小植株,同樣可以分化成苗。開放式組織培養包括無菌體系的建立,在番木瓜上目前還沒有試用。本試驗采用傳統消毒方法并在培養基內添加一定濃度“山農一號”,污染率大大下降(方法VI)。筆者還嘗試了浸泡一定濃度“山農一號”、以及常規消毒與浸泡“山農一號”相結合的四種處理,結果表明,常規消毒與8%的山農一號I型溶液浸泡10-20min相結合