高效液相色譜-二極管陣列檢測器聯用測定鎖陽中黃酮類化合物

cyykorrizan，鎖陽科植物的干燥肉質莖，是一種不含葉片的完全水生植物，主要分布在中國西北部的沙漠地區，如青海、甘肅、新疆、內蒙古、寧夏等。在傳統的中醫中，鎖陽味甘鮮有力，具有補腎陽、益血、補血、潤腸排便的功效，腰膝疲勞、陽滑、大便中之淚。現代醫學證明，鎖陽提取物對人體免疫缺陷病毒（hiv）、抗丙醇肝炎（hcv）和人成神經腫瘤有抑制作用。目前，已經從鎖陽中分離出脂肪酸、酚類、脲體、脂肪酸、黃酮、三胺、氨基酸、蛋白質和各種維生素。酚類和黃酮是黃酮類化合物中最重要的活性成分之一。目前，hplc-lad法可以同時測量環陽中兒茶素（ca）和環氨酸（ph）的含量，并進行分析和比較。1機器、材料和試劑1.1儀器和檢測方法Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司,包括G1312A二元泵、G1315B(DAD)、自動進樣器和AgilentChemstation工作站),RE-52C型旋轉蒸發儀,SHZ-D(Ⅲ)循環式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠),BT224S電子天平(德國賽多利斯儀器公司),KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).1.2鎖陽科植物鎖陽莖的鑒定鎖陽藥材分別采自甘肅敦煌、民勤、安西、河西、張掖,新疆阜康、阿克蘇,青海海西州、門源,寧夏恒武,內蒙古巴盟等11個地區,經蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定為鎖陽科植物鎖陽的干燥肉質莖,樣本存放于甘肅省天然藥物重點實驗室.1.3對照品、試劑兒茶素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號877-200001),根皮苷對照品(Sigma公司,批號083K7072),純凈水,乙腈(色譜純,北京J&KChemicalLtd.),甲醇(分析純,天津化學試劑公司),枸椽酸、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃等均為分析純.2實驗部分2.1流動相和dad色譜柱:EclipseXDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm,美國安捷倫公司);保護柱:EclipseXDB-C18(4.6mm×12.5mm,5μm,美國安捷倫公司);流動相:乙腈(P)和水(W),梯度洗脫,12%P保持不變(0~6min),12%~30%P(6~30min),流速1.0mL/min;DAD檢測波長280nm;柱溫:室溫;進樣量:10μL.色譜峰定性由對照品保留時間和紫外光譜圖確定,峰面積外標法定量.2.2標準物質和樣品溶液的制備2.2.1容量瓶溶液配制分別精密稱取兒茶素和根皮苷對照品3.10mg和0.968mg,以甲醇溶解并定容到5mL的容量瓶中,二者濃度分別為0.602mg/mL和0.194mg/mL,作為儲備液,冰箱4℃保存.用前取出放至室溫,再各稀釋5倍,濃度分別為0.120mg/mL和0.0387mg/mL.2.2.2超聲提取產物的hplc分析精密稱取晾干并粉碎的鎖陽藥材約2.0015g,加入15mL甲醇,在28kHz和50℃條件下超聲提取30min,抽濾,濾渣再加入15mL甲醇重復提取2次,抽濾,合并3次濾液,濾渣棄去.將濾液濃縮近干,濃縮殘余物以甲醇溶解并定容至5mL,靜置過夜.測定前取出,放至室溫,取上清液,過0.45μm濾膜后,直接進HPLC分析.3結果與討論3.1素和根皮苷的紫外吸收圖譜使用DAD在200~400nm全波長掃描,監測目標化合物的最大吸收波長.兒茶素和根皮苷的紫外吸收圖譜如圖1所示:兒茶素的特征吸收波長為210nm和280nm,根皮苷的特征吸收波長是225nm和285nm.盡管二者在低波長處的吸收更大,但此處色譜背景的干擾也很大,故選擇280nm對待測成分進行同時檢測.3.2流動相梯度優化由于兒茶素和根皮苷極性有差異,利用等度洗脫不能同時分離二者,故選用梯度洗脫.比較后發現,乙腈—水梯度洗脫體系的分離效果優于甲醇—水體系.優化后的梯度條件如下,流動相:乙腈(P)和水(W);梯度:0~6min保持12%P不變,6~30min12%P逐漸遞增到30%P;流速1.0mL/min.在此條件下,鎖陽樣品中的兒茶素、根皮苷與其他干擾成分完全分離,對照品和樣品的分離譜圖分別如圖2和圖3所示.3.3樣品前處理3.3.1樣品中多糖成分的檢測兒茶素和根皮苷易溶于甲醇、乙醇,比較乙醇、50%甲醇和純甲醇3種有機溶劑作提取劑對二者提取效率的影響.經HPLC實驗發現:乙醇提取物成分復雜,對兒茶素和根皮苷的分離形成干擾;50%甲醇提取液提取出了較多難溶于甲醇的粘度較大的多糖成分,干擾測定;甲醇作提取劑,既能較充分地提取出所需的黃酮成分,又能減少水溶性成分的干擾,提取液濃縮定容也容易,對HPLC測定影響也小,因此,選定甲醇為提取溶劑.3.3.2各因素作用的確定考察回流提取法、超聲提取法和索氏提取法3種提取方式,經比較發現:超聲提取法兒茶素和根皮苷含量最高,且操作簡便省時.以甲醇為溶劑進行超聲提取,按表1正交試驗設計法考察甲醇用量(A)、提取時間(B)和提取次數(C)等影響因素,結果見表2.以兒茶素和根皮苷提取含量總和為考察指標,表2中極差R值大小顯示各因素作用主次為C>B>A;表3方差分析結果表明:A、B、C3種因素均無顯著性意義(P>0.05),以A2B2C3為最佳提取條件,即優化后的最佳條件為:以藥材量7.5倍(mL:g)的甲醇超聲提取3次,每次30min.在此基礎上,再考察超聲溫度(30℃、40℃)和超聲頻率(20kHz、28kHz)對提取的影響,結果見表4:超聲頻率對結果影響不大,但溫度影響具有顯著性,溫度越高越有利于提取.通過實驗發現:50℃提取效果更好,但為防止黃酮等有效成分在高溫下發生變化,影響將來的藥效學實驗,最高提取溫度應小于50℃為宜.通過考察比較,最終確定的超聲提取方法為28kHz、50℃條件下,以7.5倍藥材量(mL:g)的甲醇超聲提取3次,每次30min.3.4方法學的檢驗3.4.1標準曲線、檢測限和檢測限用自動進樣器分別吸取0.120mg/mL兒茶素和0.0387mg/mL根皮苷的對照品溶液1μL、2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL,依次進樣,按上述色譜條件測定,以對照品進樣量(μg)為橫坐標、峰面積(mAU·s)為縱坐標繪制標準曲線.結果表明:兒茶素在0.120~3.612μg范圍內線性關系良好,根皮苷在0.0194~0.774μg范圍內線性關系良好.以3倍信噪比計算檢測限,得到兒茶素和根皮苷的檢測限分別為2.15ng和0.322ng.3.4.2加樣回收和峰面積測定由日內和日間精密度評價方法的重復性,分別取0.602mg/mL兒茶素對照品和0.194mg/mL根皮苷對照品溶液連續進樣5次,測得兒茶素和根皮苷峰面積的RSD分別為2.08%和1.92%;在6d內,每天隨機對兒茶素和根皮苷的對照品溶液進樣1次,2個待測物峰面積6次測定結果的RSD小于3%,說明方法精密度良好.3.4.3穩定性將同一鎖陽樣品溶液放置于室溫下,連續考察5d,每次進樣4μL,測得樣品中兒茶素和根皮苷含量的RSD小于3%,說明方法穩定性較好.3.4.4樣品的回收率和精密度精密稱取已知含量的鎖陽樣品5份,分別加入適量的對照品溶液,按2.2.2項“供試品溶液制備”方法進行樣品提取制備,按2.1項“色譜條件”進行分析,測得兒茶素和根皮苷的平均回收率分別為100.5%和99.26%,平行樣的RSD分別為1.87%和2.54%,說明方法準確度較高.3.5不同產地的兒茶素和根皮苷含量精密稱取11個采自中國主要不同產地的鎖陽樣品,按2.2.2項“供試品溶液制備”方法和2.1項“色譜條件”,以HPLC測定藥材中兒茶素和根皮苷的含量,每個樣品重復測定3次.樣品的典型圖譜見圖3,由圖可知待測組分沒有干擾,提取物不同組分間分辨率較好.不同產地鎖陽中2種被測物的含量由相應標準曲線計算得到,結果列于表5.由表5可知:1)不同產地供試品中兒茶素和根皮苷含量差別較大(青海海西州鎖陽兒茶素含量最高,為1.552mg/g;內蒙古巴盟鎖陽根皮苷含量最高,為0.046mg/g),尤其兒茶素含量差別更大(0.145~1.552mg/g).2)不同產地供試鎖陽樣品中2種待測物均以兒茶素含量為主,且兒茶素含量遠高于根皮苷的含量;這一結果與Chu等用毛細管電泳—安培檢測器測定鎖陽的結果一致(他們測得不同產地鎖陽中根皮苷含量為0.011~0.038mg/g,亦與本文測定結果相近),但Chu和張思巨(尤其后者)所測鎖陽樣品中兒茶素含量較本文所測結果高,其測定含量為分別0.251~2.319mg/g和0.760~20.79mg/g,這可能與藥材生長環境、采集時間及藥材的新鮮程度等有關,如張思巨等指出鎖陽樣品中兒茶素含量與藥材新鮮程度有關,同一產地鎖陽鮮品中兒茶素的含量約為陳品的3倍.4方法的準確度和