去甲烏藥堿與6-姜酚配伍對大鼠心肌收縮和收縮舒張的影響

心力衰竭是一種慢性心臟功能的損害，心臟泵血障礙的主要原因是心臟肌實質細胞的收縮能力減弱。目前治療心衰的一個重要方面是使用正性肌力藥物有效緩解心衰的癥狀。心肌正性肌力藥系指對心肌具有正性變力作用、能增強心肌收縮力,改善心臟泵血功能的一類藥物。傳統中醫典籍中雖未定義心衰,但類似心衰癥狀的早有記載,諸如呼吸困難,端坐呼吸,紫紺等。中藥的方劑和配伍制劑用于緩解心衰癥狀的治療由來已久。近期的研究表明,許多中藥的提取物或其有效成分配伍具有正性肌力作用。例如黃芪提取物可以改善阿霉素所致心衰大鼠的心功能,附子與干姜的配伍可以加快心衰大鼠的心率、升高左心室內壓、提高左心室內壓最大上升和下降速率,改善心衰大鼠血流動力學。附子的有效成分去甲烏藥堿和干姜的有效成分6-姜酚報道有心肌增強作用。但以往的研究尚多基于整體動物和離體心臟,未見在心肌細胞收縮能力的報道。本研究主要考察去甲烏藥堿和6-姜酚及其相互配伍對心肌細胞收縮的作用。1材料表面1.1n-fmoce-1去甲烏藥堿(上海永恒生物科技有限公司,批號H1-111859),6-姜酚(成都曼思特生物科技有限公司,批號MUST-11030401)。1.2動物SD大鼠250～300g,雄性,清潔級,購于維通利華公司,生產許可證號SCXK(京)2009-0007。1.3鈣臺氏液及消化液無鈣臺氏液(Tyrodesolution,mmol·L-1):NaCl140.0,KCl5.4,MgCl21.0,HEPEs10.0,D-Glucose10.0,NaOH調至pH7.4。有鈣臺氏液:在無鈣臺氏液基礎上添加1.2mmol·L-1CaCl2。KB液(mmol·L-1):KOH80.0,KCl40.0,KH2PO425.0,MgSO43.0,L-glutamic50.0,Taurine20.0,HEPEs10.0,EGTA1.0,D-glucose10.0,KOH調節至pH7.2。消化液:含0.6%collagenasetype2(Washington),0.6%BSA(Sigma),30μmol·L-1Ca2+的無鈣臺氏液。以上未標注廠商均購自Alfa。1.4儀器美國IonOptix單細胞收縮與離子測量系統進行細胞收縮功能測量2方法2.1l-1復鈣的制備取250～300gSD雄性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35g·kg-1)麻醉,開胸,迅速取出帶有一段主動脈的心臟,于4℃臺氏液清理和沖洗殘余血液,并迅速掛于Langendorff裝置上進行主動脈逆行灌注,在36.7℃,6mL·min-1,恒速灌流。有鈣臺氏液灌流3min后切換無鈣臺氏液灌流5min,之后切換為消化液。灌流中同步檢測灌注壓,當灌注壓恢復到略低于初始灌流壓力時終止消化,此時當心臟松軟、顏色變淺。用10mL無鈣臺氏液灌流沖洗殘余消化液,然后在KB液中剪取左心室,用眼科鑷撕碎,以吸管小心吹打,500r·min-1離心40s,棄去上清液,更換KB液1次,間隔6min再次更換KB液。室溫靜置1h后開始復鈣,分別用0.3,0.6,1.2mmol·L-1含Ca2+臺氏液梯度復鈣,間隔6min。隨即可用于細胞收縮功能的測量。2.2細胞收縮檢測將適量細胞置于兩側有鉑金絲電極的浴槽內,顯微鏡下尋找橫紋清晰、收縮穩定、邊界清楚的長桿狀細胞,于40×物鏡成像于計算機,使用IonOptix單細胞收縮檢測系統實時跟蹤細胞邊緣記錄收縮狀態。灌流1.2mmol·L-1Ca2+的氧飽和臺氏液,灌流速度1.5mL·min-1,給予頻率0.5Hz,波寬4ms的場刺激,細胞收縮幅度恒定5min后分別給與含有不同濃度藥物的臺氏液。2.3數據統計分析實驗數據以xˉ±sxˉ±s表示,統計使用SPSS16.0進行分析,獨立樣本和兩組數據間的比較采用雙側t檢驗,以P<0.05為顯著性差異。3結果3.1mol-1對心肌細胞的收縮作用實驗表明,去甲烏藥堿能夠增強心肌收縮力,起效迅速,洗脫后能夠恢復(圖1A)。0.03～1μmol·L-1能夠濃度依賴性增加心肌細胞的收縮幅度、最大收縮舒張速率(表1,圖1)。其EC50約為0.205μmol·L-1。高于1μmol·L-1心肌細胞即產生毒性,表現為心肌細胞不節律收縮。3.26最大收縮張量時間常數3～30μmol·L-16-姜酚對心肌細胞收縮幅度,最大收縮舒張速率,50%收縮舒張時間常數沒有影響,不能增強細胞收縮功能(表2)。大于30μmol·L-1能引起心臟的收縮功能障礙,表現為細胞的不節律收縮。3.3moll-1和3mol-1去甲烏藥堿的配伍實驗結果選用3,10μmol·L-16-姜酚與0.1,0.3μmol·L-1去甲烏藥堿進行兩兩配伍,結果顯示,配伍藥物依然能夠增強心肌細胞的收縮幅度和最大收縮舒張速率,但與單用去甲烏藥堿相比較沒有顯著性差異(表3)。4對心肌細胞的作用以往學者在心肌生化和離體水平進行了中藥強心功能的研究,證實中藥能夠不同程度的改善心力衰竭的癥狀,并闡述其作用機制。本研究在心肌細胞水平測定了藥物對收縮功能的影響,其優勢能夠直接判定藥物的作用部位,排除整體動物的個體差異和神經體液影響,利于更深入的機制研究。本研究使用附子、干姜的有效成分去甲烏藥堿、6-姜酚,并繪制其量效曲線,選擇合適濃度進行更精準的配伍研究。該研究方法所使用藥品成分單一,較少干擾。細胞實驗結果表明:0.1～1μmol·L-1去甲烏藥堿能夠增強正常大鼠心肌細胞收縮力,但高于1μmol·L-1能夠引起心肌細胞的不節律收縮,表現其毒性作用。以往分子生物學結果顯示,3～10μmol·L-16-姜酚能夠升高心肌細胞SEARCA2a活性。但3～30μmol·L-16-姜酚急性灌流心肌細胞不能改變心肌細胞收縮力,并且30μmol·L-1的6-姜酚能夠引起細胞的不節律收縮。所以配伍研究選用3,10μmol·L-16-姜酚與0.1,0.3μmol·L-1去甲烏藥堿進行兩兩配伍。結果顯示,配伍與單用去甲烏藥堿無顯著性差異。國內外在去甲烏藥堿的強心作用和機制上做了大量的工作。去甲烏藥堿是非選擇性β受體激動劑,其在血管,支氣管和心臟上廣泛發揮作用。但以往的研究尚缺乏在心肌細胞水平的研究,也沒有關于其量效曲線的報道。本研究首次報道在細胞水平起效濃度為0.1μmol·L-1,產生毒性的濃度為1μmol·L-1,EC50約為0.205μmol·L-1,治療窗較窄。這為去甲烏藥堿在整體動物和臨床用藥提供重要的理論參考。分子生物學數據顯示6-姜酚在心肌細胞能夠提高Ca-ATPase活性,增強肌漿網的鈣回攝功能,理論上能夠提高胞漿鈣的消除速率,增強舒張速率。但在心肌細胞的實驗表明急性灌流6-姜酚不能增強心肌收縮力和舒張功能。展海霞等發現附子能夠增強急性心衰大鼠的心臟功能,附子與干姜的合煎劑較單用附子作用增強。中藥的作用機制復