豬精液體外液態保存的注意事項

冷休克主要與粘膜組成有關。豬精質膜的磷脂含量很低，脂肪醇和紫磷含量很高。膽固醇的分布是不對稱性的，主要存在于質膜之外，且乙醇和乙醇的比例顯著低于其他起始因素。這些因素使豬精子對低溫特別敏感。稀釋前的豬精液在室溫下放置數小時,精子則能對冷休克產生一定程度的耐受,對于延長保存時間、保證精子存活率和頂體完整是必要的,其機理尚不清楚。最初在5~8℃保存豬精液,超過24h后,人工授精的妊娠率和胚胎存活率都較低。后來逐漸確立15~20℃為液態保存的適宜范圍,其中16~18℃在研究和生產中最常用。我們的工作也證明,豬新鮮精液在15和20℃保存48h后精子質膜完整性和存活率比4和39℃結果好。15℃是未稀釋的新鮮精液冷休克的臨界溫度,而稀釋的豬精液在12℃不發生冷休克,且保存3d后人工授精與17℃保存的結果無顯著差異,提示我們可以降低豬稀釋精液液態保存的溫度界限。2精清的高效稀釋精子射出時經副性腺分泌的精清稀釋,同時獲得運動能力。保存時稀釋精液能減弱精子運動、抑制代謝、延長體外存活時間、擴大精液體積并提高精液利用率。較低程度的稀釋促進精子運動,可能是沖淡了精清中一些抑制代謝的物質。而過度稀釋導致精子喪失運動能力、代謝活性和受精能力,即稀釋效應。BTS高度稀釋的豬精子添加10%精清后,存活率和頂體完整率均提高。精清中有維持精子運動和存活所必需的離子等,還有維持精子膜穩定和受精能力的蛋白質、抗氧化物質以及其它有益成分,過度稀釋使這些成分濃度過低,無法保護精子。過度稀釋帶來大量電解質,造成精子表面電荷過多,產生頭對頭凝集等有害反應。豬精清中可能存在去獲能因子,在體外保存中可抑制精子獲能,而稀釋會使其濃度下降,使精子過早獲能,從而加速死亡。精清中也存在一些損害精子功能的物質,降低濃度或除去更利于精子保存,如精清中的芳基磺胺酶能從對質膜有穩定作用的硫酸鹽復合糖上脫去硫酸鹽,并促進精子獲能。精液的稀釋還應考慮人工授精所需的精子總量和稀釋精液的總體積。因此,液態保存豬精液濃度一般為2.0×107~5.0×107個精子/mL,可保證每頭母豬人工授精時精子總數為3×109~4×109,以及精液體積為60~100mL的適宜用量。3利用稀釋液和保護劑為保證精子的存活、結構和功能,需要向稀釋液中添加各種成分,添加物的種類和劑量主要從精液酸堿度、離子的種類和強度、滲透壓、過氧化損傷和微生物污染等因素考慮。豬新鮮精液pH值為7.2~7.5,降低pH可使精子代謝和運動水平下降。多數豬精液稀釋液含較高濃度的葡萄糖,能使精子內pH維持在6.0以下。同其它動物相比,豬精子糖酵解代謝很弱,一般要保存在封閉容器中,使精子減少接觸氧氣,進一步抑制代謝。此外,稀釋液中的NaHCO3、檸檬酸鈉等緩沖劑可平衡精子和細菌的代謝產物,維持精子生存環境相對穩定,防止過度酸化導致精子死亡。稀釋液中采用緩沖能力更強的Tris,更利于精子長期保存。HEPES等兩性有機物的緩沖能力比無機物更強,還可鏊合有害金屬離子。豬精子可耐受的滲透壓為240~380mosM,通常等滲或稍高滲的介質比高滲的更利于保護精子功能。稀釋液的滲透壓主要由非離子物質(如葡萄糖等)維持。稀釋液的離子強度可能對精子保存不起關鍵作用,但離子強度過高會造成精子表面蛋白溶解脫落等損傷。一些離子對精子的存活和功能是必需的。較低濃度的K+維持精子膜上Na+-K+泵運轉,使胞內K+濃度大于胞外,產生ATP維持精子的存活和運動,因此在稀釋液中添加KCl可防止精子耗竭K+而喪失運動能力。還有一些離子不利于精子保存。有緩沖作用的HCO-3若過量就會使精子質膜結構改變、不穩定,誘發獲能,因此需要控制濃度。Ca2+跨膜流入胞內會啟動精子獲能,引起頂體反應,這對完成受精是必需的,但對保存卻是有害的。因此,配制稀釋液常用去離子水,并加入EDTA等鏊合Ca2+和有害重金屬離子。精子呼吸代謝能產生活性氧族(ROS),所攜帶的氧自由基氧化性很強,能氧化精子質膜的不飽和脂肪酸,干擾精子的代謝,造成過氧化損傷,這是受精能力下降的重要原因。向稀釋液中添加帶巰基物質(如Zorlesco中的半胱氨酸)可抵抗這種氧化壓力,對保護精子質膜及抑制獲能等有重要作用。向稀釋液加抗氧化劑維生素E能抑制精子質膜上多聚不飽和脂肪酸的氧化,提高精子存活率。此外,蛋白類保護劑可改善保存精液的受精能力,其中BSA最為重要。BSA可能通過多個途徑保護精子:彌補稀釋造成的精清中蛋白類運動激活物的下降,維持精子運動;克服冷卻過程中產生的溶血磷脂和自由脂肪酸造成的Ca2+易進入胞內的性質;選擇性結合精子中段和主段質膜,穩定精子結構;中和精子和細菌代謝副產物,起一定緩沖作用和抗氧化作用;減少稀釋造成的精子頭部帶相反電性電荷所引起的頭對頭凝集。但BSA在較高濃度下(3%)會誘導獲能,因此要注意用量。近年來對影響豬精液液態保存的很多因素進行了研究。1-烷基甘油醚(1-O-Alkylglycerols)能通過血小板激活因子途徑提高保存24h的豬精子運動能力和受精率。丁羥甲苯(BHT)也利于精子維持運動能力和頂體完整。在BTS中添加吲哚-3-乙酸(IAA)能顯著提高保存13d的精子頂體完整率。將提取自禽類卵黃的低密度脂蛋白片段(LDF)加入Kortowo3稀釋液,可提高精子的運動能力和頂體完整率,可能是LDF結合了精清中誘導精子質膜膽固醇外流的有害物質。在豬精液的采集和操作中,不可避免地帶入細菌等污染物,在體外保存時間若較長,微生物會過度繁殖造成精子大量死亡。因此通常向稀釋液中添加各類抗生素。慶大霉素效果較好,可對11個菌屬起抑制作用,一般用量在300mg/L。4其他稀釋液正確評價保存精液的質量、選擇高質量的精液是確保人工授精成功的關鍵。常用的精子功能檢測指標有質膜完整性、頂體完整性、線粒體活性、運動能力、尾部細胞質滴分布、獲能率和與卵結合能力等。檢測方法主要是利用光學顯微鏡、熒光顯微鏡和流式細胞計數儀等,通過應用常規染料和熒光染料、熱耐受測試、低滲膨脹測試和精卵結合實驗等,分析精子的形態和功能。在幾十年的豬繁殖研究和生產實踐中,已設計了多種液態保存稀釋液,獲得了大量數據。BTS作為一種成分簡單的稀釋液,在1~3d的液態保存中應用最多。這種稀釋液中含有K+,對維持精子胞內K+濃度正常及精子運動能力起關鍵作用。BTS保存3d的精液中,運動精子比率和頂體完整率達80%以上,產仔率約75%。Androhep稀釋液中含有BSA和HEPES等保護能力較強的成分,一般用于長期保存。Androhep保存6d的精液中,運動精子比率為76%,人工授精后分娩率為78.6%,在保存的1~6d內人工授精妊娠率無顯著變化。Modena稀釋液在維持保存5~7d精子的運動和受精能力方面優于BTS、Androhep和Kiev。在科研生產中,由于豬的種群和個體差異、飼養條件、技術人員的操作差別以及精子質量評價方法不同,即使用同樣的稀釋液和保存溫度,所得到的數據也存在差別?？偟膩碚f,一般生產中保存1~2d的精液在人工授精后,分娩率在65%~70%,而保存5d的則下降到約50%。迄今為止,還沒有單獨一種體外分析方法能準確評價精子的功能。因此,必須結合使用幾種方法,檢測多個指標,才能較準確地評價精子的功能。我們最近選用BTS、Zorlesco、Androhep及Kiev4種稀釋液,利用Hoechst33258/CTC、SYBR-14/PI/JC-1和考馬斯亮藍,連續檢測17℃下保存1~15d的豬精子質膜完整性、線粒體活性、頂體完整性和獲能狀態,發現4種稀釋液保存的效果依次為Androhep>Zorlesco>BTS>KIEV。當保存到第13d時,Androhep和Zorlesco保存的精子存活率仍在50%以上,而且這幾種方法檢測結果高度相關。這些研究結果對于選擇豬精液液態保存的適宜方法和質量評價方法具有重要意義。5輔助生殖技術豬精液的液態