甜菜堿對hepg2內基因組范圍dna甲基化表達的影響

甜菜堿是一種親水水生植物。它是甘氨酸的三甲基衍生物，也被稱為甘氨酸甜草堿和三甲基甘氨酸。由于甜菜堿的相對分子質量不大,并有3個活性甲基,在分子內部正負電荷也已得到中和,因此,它是高效的甲基供體。它可被細胞吸收并參與細胞內的甲基轉移過程。DNA甲基化作用是在真核生物體內普遍存在的一種基因內源修飾作用,是指由DNA甲基轉移酶(DNMT)催化,把S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到胞嘧啶5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5mdC)的過程,但異常甲基化則可成為腫瘤發生的重要因素之一。在許多的人類腫瘤中都可以發現不同程度的DNA異常甲基化現象。DNA甲基化與腫瘤的發生和演變密切相關,它可通過基因組總體水平甲基化程度的降低和某些啟動子區域甲基化程度的增高造成基因功能的失活,從而導致腫瘤的形成。最近的研究發現,腫瘤細胞中存在著與正常細胞不同的甲基化模式,可分為甲基化增強、甲基化減弱和甲基化酶Mtase水平提高三種類型。細胞基因的遺傳性及表觀遺傳性變異所致細胞周期的改變是惡性腫瘤的重要發病機制。在諸多調控細胞周期的影響因素中,DNA甲基化造成的表觀遺傳改變逐漸引起了人們的重視。就目前的研究發現,DNA甲基化與越來越多的細胞周期調控基因關系密切。前期研究表明甜菜堿可抑制人肝癌細胞HepG2的生長,改變細胞周期并誘導凋亡,顯示甜菜堿具有抗腫瘤活性。本實驗初步探討甜菜堿作為甲基供體,對體外培養的人肝癌細胞HepG2中整體基因組范圍DNA甲基化表達水平的細胞周期途徑的影響,進一步研究甜菜堿抗腫瘤作用機制。1材料表面1.1腫瘤細胞瘤人肝癌細胞HepG2購自美國ATCC,黑龍江省腫瘤醫院腫瘤研究所傳代保種。1.2適合自己的耐藥藥物小牛血清、RPMI-1640培養基、胰酶,(Gibco公司);甜菜堿(浙江綠成生物技術有限公司,質量分數95%);蛋白酶K、SDS、RNAaseA、nucleaseP1、2′-Deoxyadenosine(dA)、2′-deoxy-thymidine(dT)、2′-deoxyguanosine(dG)、2′-deoxycytidine(dC)、5-甲基胞嘧啶(5mdC),均購自Sigma公司;堿性磷酸酶(Fermentas公司);MTT(Sigma公司);碘化丙啶(PI,Angus公司);核糖核酸酶A(RNaseA,北京化學試劑公司);TritonX—100(Farco公司);其余試劑均為國產分析純。1.3超凈工作臺以及高效毛細管電泳儀CO2培養箱(美國NBS公司);奧林巴斯CKX—41—32倒置顯微鏡(日本Olympus公司);超凈工作臺(江蘇蘇凈集團有限公司);純水儀(美國Milipore公司);旋渦混合器(美國BohemiaN.Y公司);高效毛細管電泳儀(美國Beckman-Coulter公司);流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司)。1.4蛋白酶k1×PBS緩沖液為NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.63g、KH2PO40.24g,加蒸餾水至1000mL;TE緩沖液為Tris·Cl(pH8.0)10mmol/L、EDTA1mmol/L;細胞裂解液為Tris·Cl(pH8.0)10mmol/L、NaCl10mmol/L、EDTA1mmol/L、蛋白酶K100mg/L、SDS10g/L;蛋白酶K溶液為細胞裂解液配制0.5mL,則加入20mg/mL蛋白酶K2.5μL;堿性磷酸酶溶液:堿性磷酸酶50U/mL,溶解于2.5mol/L硫酸銨中;PI染液:生理鹽水32.4mL、PI2.5mg、RNaseA0.5mg、TritonX—1000.25mg、枸櫞酸鈉50mg,加蒸餾水至50mL,于棕色量瓶4℃避光貯存。2血清rpmi-1330HepG2細胞培養于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中,置于37℃、相對濕度95%、5%CO2培養箱中培養。2～3d傳代1次。2.2細菌分離和清洗法分離dna取對數生長期HepG2細胞,濃度為2×105/mL,鋪于6孔板中,每孔1mL,貼壁24h后,取出培養的細胞,給藥組分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4mol/L的甜菜堿,陰性對照組加入相同體積的培養液。分別于藥物作用24、48h后收集細胞,胰蛋白酶消化后,用PBS將細胞吹下,洗3次后收集到離心管中,4℃、1500×g離心10min收獲細胞。用5～10倍體積預冷的PBS重懸細胞并再次離心。TE緩沖液(pH8.0)將細胞重懸至濃度為5×107/mL,加入抽提緩沖液(每毫升細胞懸液加入10mL抽提液),于37℃溫育1h,加入蛋白酶K至終質量濃度為100μg/mL,置于50℃水浴中3h。將溶液冷卻至室溫,加入等體積的酚(水飽和酚與異戊醇混合,比例為25∶24),緩慢的來回顛倒離心管10min,小心混合兩相。于室溫以5000×g離心15min,使兩相分離。將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中,加水飽和酚重復抽提2次。收集水相,加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積的冷乙醇,DNA沉淀后,于室溫以5000×g離心5min收集。用70%冷乙醇洗滌DNA沉淀2次,DNA沉淀懸于70%乙醇中,-20℃冰箱中保存。把懸于乙醇中的DNA樣品離心,收集沉淀,將DNA重新懸浮在Milli-Q水中,質量濃度為0.5μg/mL,4℃保存。DNA樣品(3μL,0.5μg/μL)在沸水中加熱2min后,在冰浴中迅速冷卻,然后加入0.75μL10mmol/L硫酸鋅和1.25μLnucleaseP1后,37℃水浴中溫育16h。加入1.25μLTris(0.5mol/L,pH8.3)和0.75μL堿性磷酸酶,混勻后37℃水浴繼續溫育2h。取出后離心,4℃保存。使用的毛細管為未涂層熔融硅毛細管(60cm×75μm,有效長度57cm)。在本實驗中,pH9.6,16、32、48、64mmol/LNaHCO3作為緩沖液分別被采用進行試驗,每個緩沖液中還加入20～80mmol/L的SDS。溫度20～35℃,電壓在175～500V/cm,吸收波長為254nm。最后以緩沖溶液48mmol/LNaHCO3,pH9.6,緩沖溶液中加入60mmol/LSDS,電壓17kV/cm,20℃,實驗方案較好。清洗液為0.1mol/LHCl、0.1mol/LNaOH、去離子水。電泳運行之前,毛細管首先用HCl洗2min,然后用去離子水洗2min,再用NaOH洗1min,最后充滿緩沖液3min。緩沖液和洗液預先用0.45μm濾膜過濾。被水解的樣品在陰極之上9.8cm處30s內注入。樣品的甲基化定量采用5mdC占總體胞嘧啶的峰面積的百分比進行計算。實驗數據以xˉ±sxˉ±s表示,兩組間比較用t檢驗進行分析。3甜菜堿對hepg2細胞mtd的影響毛細管電泳儀分析甜菜堿對HepG2細胞甲基化表達的影響:實驗結果表明,甜菜堿作用于HepG2細胞24、48h后,采用高效毛細管電泳法檢測HepG2細胞DNA中5mdC的量。如表1中所示,細胞內的5mdC均顯著高于陰性對照組,甜菜堿0.4、0.2mol/L劑量組與陰性對照組比較差異顯著(P<0.05)。3個劑量組升高5mdC的強度具一定的劑量依賴性。從給藥時間長度來看,48h時間段內細胞內的5mdC升高的幅度較大,24h升高幅度相對較小。4甜菜堿在肺癌細胞中的應用DNA甲基化影響人類基因組的效果包括轉錄抑制,染色質結構修飾和X染色體失活,基因組印跡,抑制重復序列和寄生DNA成分對基因組完整性的損害作用。在腫瘤細胞中基因組甲基化模式常常發生改變,出現整體的低甲基化伴隨著特定區域的高甲基化。當腫瘤抑制基因發生高甲基化,造成相關基因表達沉默,并可出現細胞以缺失或者突變的方式惡性生長。現有的研究多數僅限于DNA原有的甲基化狀態或認為對其去甲基化后對基因表達的影響,很少涉及促甲基化反應的研究。目前有3種機制解釋基因組整體的低甲基化在腫瘤中所扮演的作用。第一,低甲基化導致原癌基因的去甲基化失活如MYC原癌基因失活;第二,整體的低甲基化是細胞染色體不穩定的易感因素;第三,低甲基化使腫瘤轉移增加。但是促甲基化同樣可以通過癌遺傳學途徑基因的釋能與獲能,改變基因組的不穩定性等途徑為腫瘤的防治提供新的干預點,與去甲基化相對應,他的基因分子生物學中也有著廣闊的應用前景。在人類基因組DNA中,約3%～4%的胞嘧啶堿基以5-甲基胞嘧啶(5mdC)形式存在,多種腫瘤的研究結果表明,腫瘤組織相對于正常組織整體呈現低甲基化狀態,這種特征可以通過檢測基因組中DNA甲基化胞嘧啶的豐度或者尋找帶有甲基化敏感性酶的重復序列來觀察。本實驗主要探討甜菜堿促人肝癌細胞HepG2基因組范圍為DNA甲基化高表達作用。根據文獻報道,采用了高效毛細管電泳法(HPCE)法來檢測甜菜堿作用的HepG2人肝癌細胞基因組范圍的DNA甲基化水平變化。實驗結果表明,HPCE處理DNA水解產物,用紫外光測定吸收峰值,以確定5mdC水平,再通過公式計算面積比,發現基因組整體的甲基化水平是隨著給藥濃度的增加而增加,而在腫瘤細胞DNA中5mdC的量也跟著上升,有一定的劑量依賴性,說明甜菜堿可促進HepG2細胞基因組范圍DNA甲基化水平的升高。當腫瘤細胞DNA甲基化水平提高時,有可能恢復因為去甲基化而失活原癌基因,或平衡細胞染色體不穩定的易感因素,或導致細胞周期調控失常,信號傳導等來達到抑制腫瘤的作用。研究提示,甜菜堿可能通過促使腫瘤細胞DNA甲基化的升高,使得DNA甲基化模式隨著細胞分裂穩定的復制,而甲基化的異常更易于