雙向電泳技術在蛋白質組研究中的應用

隨著后基因組時代的開始，蛋白質組的研究越來越受國內外科學家的關注，這是一個現在成為世界的先潮和熱點領域。它是指一個基因組、一種細胞或組織所表達的全部相應的蛋白質。蛋白質組的研究是為了識別及鑒定一種細胞或組織所表達的全部蛋白質及它們的表達模式。開展蛋白質組研究,首先要針對蛋白質組的復雜體系,建立同時對數千種蛋白質進行識別、規模化數據處理、高通量鑒定、自動化系統配套的蛋白質組研究技術體系,并且該體系具有靈敏度高、準確度好、重復性好的特點。雙向電泳(2DE)技術是研究蛋白質組最具實用價值的核心方法。雙向電泳的分辨率涉及蛋白質樣品處理、等電聚焦(IEF)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)、染色等技術,我們以人胚肺成纖維細胞和蠶卵蛋白質進行了雙向電泳實驗條件優化,得到了滿意的雙向電泳圖譜。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蛋白質分子質量變化7cm、13cm、24cmIPG干膠條(pH3～10L),IPG緩沖液,尿素,硫脲,Tris,CHAPS,十二烷基硫酸鈉(SDS),溴酚藍,二硫蘇糖醇(DTT),瓊脂糖,甘油,覆蓋油,蛋白質分子質量標準分別為AmershamBiociences和華美公司產品,PlusOne2DCleanupKit均為AmershamBiosciences公司產品。丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,過硫酸銨,甘氨酸,TEMED購自上海生工生物工程公司,其余試劑為國產分析純,所有溶液均用Milli-Q水配制。1.1.2儀器、檢測方法IPGPhor等電聚焦電泳儀,MiniVE電泳槽,SE600垂直電泳槽,EttanDALTⅡ垂直電泳系統,Imagescanner高精度掃描儀,Hoefer自動凝膠染色儀,紫外可見光蛋白質核酸分析儀均購自AmershamBiosciences公司,低溫高速離心機(德國,Heraeus)。1.1.3溶液制備1.1.3.1樣品溶液7mol/L尿素,4%CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。1.1.3.管管保存8mol/L尿素,2%CHAPS,分裝成0.5ml/管,-20℃保存。使用前2.5mlIPG溶脹液加入7mgDTT,0.5%IPG緩沖液(3～10L),少量溴酚藍。1.1.3.s-溴酚藍-3-溴銅-堿法50mmol/LTris-HCl(pH8.8),6mol/L尿素,30%甘油,2%SDS,少量溴酚藍。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。1.1.3.4-發明的藍色溶液1%溴酚藍,50mmol/LTris-HCl,分裝成0.5ml/管,-20℃保存。1.1.3.130%橡膠儲存30%丙烯酰胺,0.8%甲叉雙丙烯酰胺,0.45μm微孔濾膜過濾后,避光貯存于棕色瓶中,4℃保存。1.1.3.6.凝膠緩沖液儲存液1.5mol/LTris-HCl(pH8.8),0.45μm微孔濾膜過濾后,4℃保存。1.1.3.7sds電子緩沖液25mmol/LTris-HCl(pH8.3),192mmol/L甘氨酸,0.1%SDS。1.1.3.8銀鉻溶液和儲存溶液參照郭堯君著《蛋白質電泳實驗技術》配制。1.2實驗方法1.2.1樣品制備1.2.1.細胞裂解液制備選用對數生長期的HLF細胞,用5mmol/L醋酸鎂洗滌3次,加入細胞裂解液,反復振蕩混勻、沉淀,4℃,12000r/min,30min,取上清,用PlusOne2DCleanupKit處理,Lowry法定量,蛋白質濃度為3.22mg/ml。1.2.1.核心蛋白的提取收集10只催青期的蠶卵,液氮研磨,加入1ml含蛋白酶抑制劑PMSF的樣品裂解液,振蕩30sec,冰上放置10min,4℃,12000r/min離心10min,取上清,用PlusOne2DCleanupKit處理,Lowry法定量,蛋白質濃度為2.45mg/ml。1.2.2制造橡膠按表1配方配制SDS均一凝膠液。參照Ettan.DALDⅡ系統操作指南灌制15%SDS凝膠。1.2.3ipg總蛋白的溶脹行為等電聚焦電泳主要按Gorg描述的后經Sanclez等人改進的膠內加樣方法進行,并參照IPGphor等電聚焦系統操作指南。將IPG干膠條在室溫中平衡10min,將一定量的總蛋白與溶脹液混合,并均勻加入IPG持膠槽中,IPG干膠條膠面朝下放入持膠槽,并覆蓋一層礦物油,蓋好蓋子后置于IPGPhor等電聚焦儀電極板上,溶脹后進行等電聚焦,溶脹和等電聚焦程序按表2參數在20℃下自動進行。等電聚焦結束后,迅速取出帶樣品的IPG膠條于平衡液中緩慢振蕩平衡2次,每次15min,用濕潤的濾紙吸去膠條多余的平衡液。1.2.4電泳參數設定將平衡后的IPG膠條移至SDS凝膠上端,0.5%瓊脂糖封膠。SDS分別在MiniVE電泳槽(7cm膠條)、SE600垂直電泳槽(13cm膠條)和EttanDALTⅡ電泳槽(24cm膠條)中進行,電泳參數設定見表3,直到溴酚藍到達膠的底線。為確定蛋白質的分子質量,在凝膠上端膠條的右側加入蛋白質分子質量標準,分子質量標準加樣方法為:將8μl分子質量標準與等體積的0.5%瓊脂糖混合后,點樣于專門濾紙上,干燥后再移入凝膠上端膠條的右側。1.2.5染色、刷、顯色、充色采用郭堯君著《蛋白質電泳實驗技術》銀染方法并作適當改動。7cm和13cm膠用Hoefer自動凝膠染色儀編制程序染色,24cm膠用手動染色盤按同樣程序染色。SDS膠用含25%乙醇、10%冰醋酸的固定液至少固定2h。再進行敏化、銀染、顯色和終止,每一步驟后都要用去離子水漂洗。染色后,凝膠用Imagescanner高精度掃描儀透射掃描,分辨率采用300dpi。掃描后凝膠置凝膠保存液中保存。2蛋白質組的分離算法我們采用第一向為IPG等電聚焦,第二向為SDS垂直電泳系統,按照上述摸索的實驗條件,對人胚肺成纖維細胞和蠶卵蛋白質進行雙向電泳(2DE),分別獲得了滿意的蛋白質雙向電泳圖譜,結果見圖1、圖2。開展蛋白質組研究,首先要針對蛋白質組的復雜體系,建立同時對數千種甚至數萬種蛋白質進行分離的靈敏度高、分辨率高、準確度好、重復性好的雙向電泳技術體系。本文以人胚肺成纖維細胞和蠶卵蛋白質為樣品,采用固相pH梯度(IPG)等電聚焦(IEF)為第一向,垂直SDS為第二向,對樣品制備,等電聚焦上樣方法及上樣量對電泳的影響、等電聚焦電泳及SDS程序及參數設定,SDS凝膠染色進行了研究和實驗條件的建立和優化,建立了蛋白質組研究的雙向電泳技術平臺,可推廣應用于其它不同組織、不同細胞樣品的雙向電泳。2.1蛋白質的溶解及雙向電泳的穩定性樣品制備是蛋白質組研究過程中的首要步驟,是2DE成功與否的關鍵,直接影響蛋白質組研究結果。人胚肺成纖維細胞與蠶卵相比,蛋白質提取方法簡單。蠶卵中成分多且復雜,我們曾嘗試用細胞破碎的方法,但樣品損失大,最終采用蠶卵混合液氮研磨成粉末,加入樣品裂解液再混勻的方法。為了獲得較好的雙向電泳圖譜,在樣品處理過程中,采用了如下措施。(1)為了防止蛋白質的降解,裂解液中加入蛋白酶抑制劑PMSF。(2)為了增加蛋白質的溶解度,使用高濃度的高純尿素,但配制高濃度尿素溶液時,尿素很難溶解,需攪拌較長時間才能完全溶解,這時不要對溶液進行加熱,因為超過30℃會導致蛋白氨基化。(3)因為離子性表面活性劑(SDS)與IEF凝膠不相容,裂解液中加入非離子表面活性劑4%CHAPS以增強疏水性蛋白質的溶解性。(4)溶脹液使用前加入二硫蘇糖醇(DTT)作還原劑斷開蛋白質分子內的二硫鍵,使蛋白質折疊完全打開。(5)樣品中的鹽離子等雜質將影響IEF,如果樣品中鹽分太高,使樣品的電內滲增高,等電聚焦電壓上不去,導致IEF時間延長,并嚴重影響雙向電泳效果。我們選用AmershamBiosciences公司專門用于雙向電泳樣品中去除鹽等成分的2DCleanupKit處理樣品,有時甚至連續處理兩次,得到了很好的效果。(6)IEF前樣品中蛋白質含量測定的準確性,直接關系到IEF上樣量的確定,雙向電泳圖譜蛋白點的多少。重復性也是雙向電泳成功的關鍵因素,我們采用Lowry法測定蛋白質含量,其重復性好,保證了蛋白質含量的準確性。如果樣品蛋白質含量太低,也會影響測定結果,這時可以將樣品真空冷凍干燥后,使用更小量溶液溶解,以提高蛋白質含量。2.2膠條電泳結果我們采用IPG等電聚焦為第一向,IPG等電聚焦分辨率高,而且IPG預制膠條重復性好,操作簡便,一次同時可跑12塊膠條,便于蛋白質組的比較研究。為了更好地觀察蛋白質組,在試用了7cm和13cm膠條后,使用了最長24cmpH3～10的膠條。從電泳結果觀察,人胚肺成纖維細胞成分簡單些,蛋白質得到了較好的分離,見圖1。蠶卵蛋白質成分復雜,蛋白質廣泛分布于pH3～10的范圍,7cm、13cm膠條電泳結果,蛋白點較密集,蛋白點之間不易區分,而且在膠條兩端,仍有部分蛋白質沒有在等電聚焦得到很好的分離,見圖2A、圖2B。使用了24cm膠條后,上述問題得到了較好的解決。見圖2C。為了滿足蛋白質組分析的要求,實驗中,我們對不同等電聚焦電泳程序,上樣量,聚焦時間進行了比較研究,摸索了優化的電泳條件(見表2)。2.3蛋白質點染色第二向采用垂直SDS,同時可跑多張膠,尤其是EttanDALTⅡ系統一次同時可跑12張24cm膠,分辨率高,這樣便于蛋白質組比較研究,有利于提高上樣量,保證電泳后有足夠的蛋白質量進行進一步分析。而且EttanDALTⅡ系統可調節控溫和電壓時間程序,使蛋白質得到較好的分離,缺點是需大量的緩沖液,電泳時間較長。為了得到沒有擴散平整的蛋白質分子質量標準條帶,便于雙向電泳圖譜分析,通過改進分子質量標準加樣方式,得到了平整的分子質量標準條帶,見圖2。蛋白質點