食品微生物風(fēng)險評估的常用方法

單核細(xì)胞增多（以下簡稱單增）是一種由人類感染的食物來源。廣泛分布于自然界、土壤、廢水、人和動物糞便和其他食物中。該菌的主要特點(diǎn)是:為一種隨機(jī)性病原體,孕婦、胎兒或新生兒、老年人、患有嚴(yán)重疾病及免疫受損者為易感人群;其引起的食源性李斯特菌病相對少見,但十分嚴(yán)重,死亡率高達(dá)20%~30%;生長溫度范圍為1~45℃,在冷藏溫度下可以大量地生長繁殖。由于該菌污染食品種類較多、在冷藏溫度下可以繁殖及引發(fā)疾病嚴(yán)重等特點(diǎn),WHO將其作為20世紀(jì)90年代四大食源性致病菌之一。20世紀(jì)80年代,北美洲和歐洲先后幾次出現(xiàn)了同一來源的李斯特菌病的大暴發(fā)之后,人們才意識到食品是導(dǎo)致人類感染的主要傳播途徑。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心報(bào)道,美國每年約有2500例李斯特菌病例,其中約有20%死亡。1999年,單增引起的致死率在所有食源性致病菌中位居第二位,引起的住院率位居第一位(90%)。2007年11月,美國馬薩諸塞州發(fā)生了一起由當(dāng)?shù)嘏Ｄ虉錾a(chǎn)的巴氏消毒乳引起的單增感染的暴發(fā),造成了5人感染,3人死亡。歐洲疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計(jì)顯示,1999-2006年,在23個歐盟成員國中李斯特菌病的病例數(shù)呈上升趨勢,2006年確診的病例數(shù)為1583例,是1996年病例數(shù)的2.4倍,發(fā)病率為0.3/100萬,其致死率超過30%,住院率高達(dá)91%。據(jù)澳大利亞食源性監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計(jì),2006年報(bào)道的李斯特菌病為59例,發(fā)病率為3/100萬,與2001-2005年報(bào)道的平均發(fā)病率(3.2/100萬)相似。OKUTANIA等人對日本由單增引起的人類感染進(jìn)行了全國調(diào)查,預(yù)計(jì)在日本每年李斯特菌病的病例數(shù)為83例,發(fā)病率為0.65/100萬。李斯特菌病的社會及經(jīng)濟(jì)影響已逐漸位居食源性疾病之首。李斯特氏菌在環(huán)境和食品中分布廣泛,肉制品、乳制品、水產(chǎn)品以及蔬菜和水果等很多種食品均有可能被李斯特氏菌污染,但李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)病例主要與即食食品有關(guān)。國際食品衛(wèi)生法典委員會(1999a)確認(rèn)的21種引起關(guān)注的病原體-食品組合中,單增-即食食品為其中的一個組合。根據(jù)國際食品法典委員會的定義(1999b),即食食品包括任何通常可生食的食品(包括飲料),或經(jīng)處理、加工、混合、烹制或其他方式制備的、通常無需進(jìn)一步加工即可食用的食品。由于各國的飲食習(xí)慣、冷鏈的可用性和完整性及特定的法規(guī)存在差異,不同國家即食食品涉及的種類可能存在不同。鑒于李斯特菌病的嚴(yán)重程度及其在世界范圍的廣泛流行,為估計(jì)不同種類即食食品對人類健康的影響,建立能顯著減少食源性李斯特菌病發(fā)病率的食品控制措施,國際組織及一些國家相繼開展了即食食品中單增的風(fēng)險評估工作。完整的定量評估主要采用國際食品法典委員會描述的四步風(fēng)險評估方法,但在資源有限的情況下,也有部分評估者采用分級工具對即食食品中的單增進(jìn)行了定性或半定量的評估。1定量風(fēng)險評估1999年,國際食品法典委員會發(fā)布了“進(jìn)行微生物風(fēng)險評估原則和準(zhǔn)則(CAC/GL30)”,對風(fēng)險評估的概念和構(gòu)架進(jìn)行了明確的闡述。微生物風(fēng)險評估主要評估食品中的病原菌及其毒素可能對人群引起的潛在危害。評估程序包括識別食品中病原菌、真菌和真菌毒素、病毒和寄生蟲等生物危害因素;對某種危害因素進(jìn)行特征性描述;人群對相關(guān)危害的暴露概率、暴露水平及嚴(yán)重程度;可能對健康產(chǎn)生不良影響的定性/定量分析等,即危害識別、危害特征描述、暴露評估和風(fēng)險特征描述四個過程。目前,FAO/WHO微生物風(fēng)險評估聯(lián)合專家會議(thejointFAO/WHOexpertmeetingsonmicrobiologicalriskassessment,JEMRA)及美國農(nóng)業(yè)部(UnitedStatesdepartmentofagriculture,USDA)食品安全監(jiān)督局(foodsafetyandinspectionservice,FSIS)和美國食品藥品管理局(UnitedStatesfoodanddrugadministration,FDA)均已完成了對即食食品中單增的風(fēng)險評估并出版了完整的評估報(bào)告。此外,也可見各國對特定食品中單增進(jìn)行評估的文獻(xiàn)報(bào)道。1.1JEMRA的風(fēng)險評估應(yīng)國際食品衛(wèi)生法典委員會的要求,為了對“應(yīng)用食品衛(wèi)生一般原則控制食品中單增的準(zhǔn)則(CAC/GL61)”的制定提供科學(xué)建議,并使成員國可以應(yīng)用該風(fēng)險評估結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險管理,JEMRA對即食食品中的單增進(jìn)行了風(fēng)險評估。該風(fēng)險評估的設(shè)計(jì)旨在解決三個問題:在食品中微生物的數(shù)目從25克無致病菌到每克或每毫升含有1000菌落形成單位(Colony-FormingUnits,CFU)范圍內(nèi),評估食品中單增導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重風(fēng)險;評估不同易感人群相對于普通群體患嚴(yán)重疾病的風(fēng)險;評估特定食品中單增導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的風(fēng)險。由于已經(jīng)認(rèn)識到了單增的危害,因此,以下從風(fēng)險評估的第二步進(jìn)行描述。1.1.1危害特征描述建立單增的劑量反應(yīng)關(guān)系模型是這一部分的重點(diǎn)內(nèi)容。由于無法通過人類志愿者進(jìn)行單增的研究或通過替代病原菌的研究獲得劑量反應(yīng)數(shù)據(jù),因此,只能根據(jù)專家的推算、流行病學(xué)或動物試驗(yàn)資料,或者綜合這些結(jié)果來確定并評估劑量反應(yīng)關(guān)系。常用的劑量反應(yīng)模型包括指數(shù)模型、雙參數(shù)模型及Weibull-Gamma模型等。這些劑量反應(yīng)模型都有其獨(dú)特的特征,但也存在一定的局限性。JEMRA在考慮了單因素模型的簡易性及推斷低劑量影響范圍的線性特征的情況下,充分利用了流行病學(xué)資料和美國FDA在風(fēng)險評估過程中已經(jīng)獲得的暴露評估資料,制定了一個基于指數(shù)模型的簡化的劑量反應(yīng)模型來描述劑量反應(yīng)關(guān)系,即P=1-e-r*N。其中,P表示嚴(yán)重疾病(侵染性李斯特菌病)的概率,N代表攝入單增的數(shù)量,r代表單一細(xì)菌導(dǎo)致侵襲性李斯特菌病的概率。r值是根據(jù)美國2001年暴露模型中的食品污染分布以及疾病預(yù)防控制中心對李斯特菌病估計(jì)病例數(shù)倒推而得到的。由于對每份食品中單增的最高含量存在著不確定性,因此針對上述三個不同問題采用了不同的r值。針對第一個問題,對易感人群使用的r值為5.85×10-12;針對第二個問題,對一般健康人群的r值選擇5.34×10-14作為參考;針對第三個問題,所使用的r值是基于MonteCarlo模擬技術(shù)與不連續(xù)分布的結(jié)合。假定攝入單增的最大數(shù)量在(7.5~10.5)log10CFU之間,對易感人群使用的r值的中位數(shù)就是1.06×10-12,對健康人群使用的r值的中位數(shù)就是2.37×10-14。1.1.2暴露評估由于難以考慮所有的即食食品,JEMRA選擇了4種有代表性的即食食品進(jìn)行評估,即消毒牛奶(受污染的幾率和程度小,貯藏期間有利于該菌生長)、冰淇淋(受污染的幾率和程度小,貯藏期間該菌無法生長)、發(fā)酵肉類(易受污染,貯藏期間阻止該菌生長)和冷藏熏魚(易受污染,貯藏期間可使該菌生長)。暴露評估的目的是想得到消費(fèi)時食品中微生物的流行情況及濃度。在此暴露評估中僅考慮了從食品零售至消費(fèi)之間污染頻率和程度的變化情況,以簡化模型并降低模型的不確定性,從而減少了最終風(fēng)險估計(jì)值的變動范圍。通過收集零售時產(chǎn)品污染的數(shù)據(jù),形成一個累積頻率分布;考慮消費(fèi)前致病菌生長繁殖的影響因素,如:貯藏溫度(累積分布)、貯藏時間(三角分布)、在不同食品中單增的生長速度(采用預(yù)測性模型評估單增在食品中的生長速度、失活速度及生長限制)等;結(jié)合食品消費(fèi)的數(shù)量和頻率,將各種因素?cái)M和到模型中,從而獲得消費(fèi)時食品中單增的濃度,以log10CFU/份污染食品的累積概率來表示。1.1.3風(fēng)險特征描述將暴露評估的結(jié)果用在劑量反應(yīng)模型中,進(jìn)行風(fēng)險特征描述,計(jì)算出患李斯特菌病的概率。最后結(jié)果采用在健康和易感人群中每百萬份食品產(chǎn)生的風(fēng)險來表示。每份食品的風(fēng)險和食品份數(shù)被用來估計(jì)特定群體中每年的病例數(shù)目。4種食品比較,冷藏熏魚每份食品的風(fēng)險最高,為每份5.3×10-8個病例,但其在全球的消費(fèi)率不高,所以每年李斯特氏菌病的總病例數(shù)中等(0.16/100萬)。每份牛奶的風(fēng)險估計(jì)很低,為每份5.0×10-9個病例,但牛奶的消費(fèi)頻率很高,預(yù)測每年發(fā)生李斯特菌病的病例數(shù)最高,為每0.91/100萬。將牛奶和冰淇淋在食品構(gòu)成、食品分量、消費(fèi)頻率、最初污染的速度和程度上具有相似之處的兩類食品進(jìn)行比較可見,由于牛奶在貯存期間有助于微生物生長繁殖的特性使得每百萬份牛奶的風(fēng)險估計(jì)值要比冰淇淋高出近100倍。同樣,熏魚的風(fēng)險比發(fā)酵肉制品的相應(yīng)風(fēng)險高出近10000倍。1.1.4評估結(jié)論為了回答風(fēng)險管理者的三個問題,在評估過程中,評估者根據(jù)問題對模型中的參數(shù)進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整,以得到不同的預(yù)測結(jié)果。結(jié)論是:所用模型的預(yù)測結(jié)果表明,幾乎所有的李斯特菌病均是因食用了大量的致病菌所致;尚無清楚的證據(jù)證明食用特定數(shù)量的單增所產(chǎn)生的風(fēng)險會因國家不同而異,不同國家在食品制作和處理方法上的不同可能會影響污染的模式,從而影響每份食品風(fēng)險的大小;防止食品食用時出現(xiàn)嚴(yán)重污染的控制措施,對降低李斯特菌病的發(fā)病率有極大的作用;大多數(shù)的李斯特菌病與食用不合格的食品有關(guān),這些食品不符合現(xiàn)行的單增食品標(biāo)準(zhǔn),而與該限量標(biāo)準(zhǔn)(不得含有該菌或100CFU/g)無關(guān)。1.2美國的評估1.2.1美國FDA/FSIS對即食食品的評估1.2.1.1危害特征描述FDA是從致病菌的毒力、宿主的易感性及食源性疾病的監(jiān)測三個方面收集數(shù)據(jù),所應(yīng)用的劑量反應(yīng)模型建立在小鼠模型的基礎(chǔ)上,采用換算因子通過美國CDC每年死亡率的估計(jì)對模型進(jìn)行調(diào)整,將致死率作為終點(diǎn),對三組人群(圍產(chǎn)期、老年人和中年人)進(jìn)行劑量反應(yīng)評估,針對每個群體推導(dǎo)出一個劑量反應(yīng)模型,曲線的位置與美國年度疾病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相吻合。1.2.1.2暴露評估評估中的一些即食食品未經(jīng)加工或售賣前經(jīng)過一些加工,仍有一些即食食品在售賣前經(jīng)過充分加工,但由于隨后經(jīng)過處理和貯藏而增加了再污染的可能性。同時,根據(jù)食品本身的特性將食品分成了5大類(海產(chǎn)品、農(nóng)產(chǎn)品、乳制品、肉制品及混合食品)23小類食品。研究中對零售時食品中的單增、零售和消費(fèi)之間的增長、貯存時間和溫度的交互作用、熱滅活及消費(fèi)時食品中的單增等幾個模型進(jìn)行描述。并考慮了每年的食品份數(shù)和食品的污染量。對于不同即食食品來說,由于每餐中消費(fèi)的食品數(shù)量不同,每年消費(fèi)的餐數(shù)也大不相同。以全美國國民為例,每年消費(fèi)的巴氏消毒乳是8.7×1010份,每份244g;熟肉制品是2.1×1010份,每份56g;熏制海產(chǎn)品是2×108份,每份57g。每人每年消費(fèi)的受污染的餐次(1300次)中,平均每餐含不到一個細(xì)菌;有19次的含量在1.0~1000CFU/g之間,有2.4次的含量在1000~1000000CFU/g之間。每人每年單增含量超過100萬個的餐次數(shù)不到1個。1.2.1.3風(fēng)險特征描述風(fēng)險特征描述整合了危害確定、危害特征描述和暴露評估的信息,對既定人群中可能發(fā)生的負(fù)面影響進(jìn)行評估。主要描述食用23類食品中每一類食品的每份食品感染單增引發(fā)疾病的相對概率。在美國,熟肉制品、法蘭克福香腸和肉醬(估計(jì)約每107份中就會產(chǎn)生一個李斯特菌病例),比硬脂干酪、發(fā)酵乳制品和再制干酪(估計(jì)約每1014份中會產(chǎn)生一個李斯特菌病例)會產(chǎn)生更大的風(fēng)險。主要原因是即便在冷凍的貯存環(huán)境中前一組食品也會易于單增的生長,而后一組食品則不易于該菌的生長。劑量反應(yīng)曲線表明老年人群和圍產(chǎn)期人群比普通人群更容易感染李斯特菌病。1.2.1.4評估結(jié)論風(fēng)險評估結(jié)果證明了流行病學(xué)結(jié)論:食源性李斯特菌病雖然嚴(yán)重、但相對少見,美國消費(fèi)者對單增的暴露水平是低度到中度;特定食品可能是單增的載體;針對三組人群對單增不同水平暴露的預(yù)期致死率,建立了三個劑量反應(yīng)模型,引起李斯特菌病的單增的量值取決于個體的免疫情況;確定有5個因素影響食品消費(fèi)時對單增的暴露,即:消費(fèi)即食食品的頻率和水平、即食食品中單增的頻率和水平、貯藏過程中食品對單增生長的潛在影響、冷凍貯存溫度及食用前的冷凍貯藏。可以考慮針對這些因素降低食源性單增風(fēng)險的戰(zhàn)略。1.2.2美國FSIS對熟肉制品中單增的風(fēng)險評估1.2.2.1評估背景由于1999年2月發(fā)生了由熱狗和熟肉制品引發(fā)的李斯特菌病的暴發(fā),FSIS為了能充分解決單增的問題,要求所有生產(chǎn)即食畜禽肉制品的公司在致死性處理和終產(chǎn)品包裝前對食品接觸面的李斯特菌屬(Listeriaspecies)進(jìn)行環(huán)境檢驗(yàn),并建議大公司增加食品接觸面李斯特菌屬的檢驗(yàn)頻率。鑒于這種檢驗(yàn)頻率以及食品接觸面李斯特菌屬的檢驗(yàn)與產(chǎn)品中單增檢驗(yàn)之間的關(guān)系缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)或風(fēng)險評估,因此,FSIS決定在收集各方意見的基礎(chǔ)上啟動這項(xiàng)評估。評價的具體問題包括:不同食品接觸面檢驗(yàn)和衛(wèi)生政策對降低即食產(chǎn)品中單增污染及疾病或死亡風(fēng)險的效果;包裝前或包裝后干預(yù)及生長抑制劑的使用等其他干預(yù)措施對降低即食產(chǎn)品中單增污染及疾病或死亡風(fēng)險的效果;對食品接觸面的李斯特菌屬進(jìn)行檢驗(yàn)可提供的指導(dǎo)。1.2.2.2評估原理FSIS的評估采用了兩個連續(xù)的模型:工廠內(nèi)(in-plant)模型及更新的零售-餐桌的FDA/FSIS暴露評估和FDA/FSIS劑量反應(yīng)關(guān)系模型。應(yīng)用現(xiàn)有資料建立工廠內(nèi)MonteCarlo模型,定量描述工廠環(huán)境內(nèi)的李斯特菌屬和零售時熟肉制品中單增的關(guān)系。將工廠內(nèi)模型的結(jié)果(例如:零售時熟肉制品的單增濃度)輸入FDA/FSIS熟肉制品從零售-餐桌的暴露途徑。得出從零售到餐桌的熟肉制品中單增的劑量,并估計(jì)食用這些即食產(chǎn)品導(dǎo)致疾病或死亡的相對風(fēng)險。工廠內(nèi)動力模型采用MicrosoftVisualBasic6.0界面來運(yùn)行,將工廠分為大、小、非常小三個規(guī)模,涉及的資料包括工廠資料(如:不同規(guī)模的工廠生產(chǎn)產(chǎn)品的比例、平均產(chǎn)量、采取衛(wèi)生措施的效果、食品接觸面的檢驗(yàn)頻率)、污染資料(如:污染事件發(fā)生的頻率、污染事件持續(xù)的時間、污染的劑量、轉(zhuǎn)換系數(shù)、食品接觸面的面積)、加工后資料(如:加工后處理、生長抑制劑)和進(jìn)一步資料(如:檢出限、李斯特菌屬檢驗(yàn)陽性檢出單增的比率、加工后生長系數(shù))4個部分,進(jìn)一步資料中涉及的參數(shù)通常為相對固定的參數(shù)。軟件中所涉及參數(shù)的表示形式主要為變量分布,假設(shè)檢驗(yàn)的批次為1000000個,運(yùn)行軟件得到即食食品零售時單增的濃度。此風(fēng)險評估模型可以評價不同干預(yù)措施對控制工廠內(nèi)李斯特菌屬導(dǎo)致的即食產(chǎn)品中單增污染效果,降低由該單增引起的疾病或死亡風(fēng)險效果,并通過改變模型中食品接觸面的檢驗(yàn)頻率和衛(wèi)生措施、包裝前后干預(yù)、生長抑制劑、加強(qiáng)衛(wèi)生措施以及綜合使用各項(xiàng)措施等操作,提供幾種結(jié)果來說明具體風(fēng)險管理問題。1.2.2.3評估結(jié)論此次評估的結(jié)論為:李斯特菌屬陽性的食品接觸表面增加了在即食食品批次中發(fā)現(xiàn)單增陽性的可能性;李斯特菌屬陽性的食品接觸表面污染的頻率包含了寬泛的時間框架,污染事件的持續(xù)時間約為1周;所建議的食品接觸表面檢驗(yàn)和衛(wèi)生措施的最低頻率可導(dǎo)致零售時熟肉制品單增含量的略微降低;增加食品接觸表面檢驗(yàn)和衛(wèi)生措施的頻率可適當(dāng)降低李斯特氏菌病的風(fēng)險;組合干預(yù)措施(如食品接觸表面的檢驗(yàn)和衛(wèi)生措施、包裝前和包裝后干預(yù)、使用生長抑制劑等)與任何單一措施相比,更能有效地緩解即食產(chǎn)品中單增的潛在污染并降低疾病或死亡的風(fēng)險。1.3其他各國的評估根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,各國已相繼對特定食品中的單增進(jìn)行了風(fēng)險評估。例如:POUILLOTR等采用MonteCarlo模型對法國冷薰鮭魚中的單增進(jìn)行定量風(fēng)險評估;YANGH等也采用MonteCarlo模型對美國消費(fèi)階段熟肉制品中的單增進(jìn)行風(fēng)險評估,根據(jù)模型估計(jì),在消費(fèi)階段食品中有0.3%份被104CFU/g的單增污染,估計(jì)中年人群消費(fèi)熟肉制品的平均風(fēng)險為每1011份食品引起7人死亡,家庭食品加工處理使得平均致死率增加了106倍。SANAAM,COROLLERL等采用MonteCarlo模型對法國由原乳制成的兩種軟干酪中的單增進(jìn)行風(fēng)險評估,模型評估結(jié)果為:兩種干酪污染單增引起的李斯特氏菌的發(fā)病率分別為≤103/(1.7×107)份干酪及≤2.5×103/(4.8×108)份干酪。我國的麻麗丹等結(jié)合風(fēng)險分析軟件包@Risk4.5和Excel,對丹東口岸進(jìn)口冷凍水產(chǎn)品中攜帶的單增進(jìn)行定量風(fēng)險評估,評估的食品類別為丹東口岸從朝鮮進(jìn)口冷凍章魚、海螺、紫石房蛤、江瑤貝、青柳蛤肉、河螺肉、河蝦、蟹子、香螺和其他貝類。評估結(jié)果為消費(fèi)由丹東口岸從朝鮮進(jìn)口的冷凍章魚、海螺、紫石房蛤、江瑤貝、青柳蛤肉、河螺肉、河蝦、蟹子、香螺和其他貝類不具有風(fēng)險,引起李斯特菌病的概率幾乎為零。2.1分級工具的運(yùn)用上述的風(fēng)險評估方法均為定量的風(fēng)險評估方法。定量風(fēng)險評估可以數(shù)值的形式表示風(fēng)險,并指出各種不確定性。但該評估方式耗時、耗力,花費(fèi)也較高,需要微生物、統(tǒng)計(jì)、流行病等不同專業(yè)領(lǐng)域的人員參與。在目前情況下,許多國家由于數(shù)據(jù)不足也難以完成此評估。通過簡單的評估進(jìn)行預(yù)先篩選的方法能夠確定是否需要投入大量資源進(jìn)行完整的定量風(fēng)險評估,且可以用大量存在的支持性“工具”幫助決策是否某一致病菌是既定的食品/食品加工組合,這些包括各種不同的半定量篩選體系(如RiskRanger)、決策樹等分級工具