淺談新生代的親屬因子

1987年，laskey通過對兩組蛋白素和dna的外部生理強度進行實驗時發現，需要在內核中含有一些酸性蛋白質，這些物質可以轉化為核小型體。否則，就會沉淀，提出了最初的分子伴侶概念。后來,Ellis在研究高等植物葉綠體中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)時也發現類似現象,即在葉綠體中合成的8個大亞基以及在細胞質中合成的8個小亞基,都必須先和一種蛋白結合后,才能在葉綠體內組裝成活性酶分子。因此提出在普遍意義上幫助新生肽鏈折疊的分子伴侶概念。1993年Ellis對分子伴侶的定義是:分子伴侶是一類相互之間有關系的蛋白,它們的功能是介導蛋白質正確的折疊與裝配,但并不構成被介導的蛋白質的組成部分。現今這個概念已得到了補充和發展。1分子落實論co-so的結構與功能目前認為,分子伴侶(molecularchaperone)是指能夠結合和穩定另外一種蛋白質的不穩定構象,并能通過有控制的結合和釋放,促進新生多肽鏈的折疊、修飾、裝配、以及錯誤多肽鏈的降解。應該指出的是,分子伴侶是從功能上定義的,凡具有這種功能的蛋白質都是分子伴侶,它們的結構可以完全不同。這一概念目前已延伸到許多蛋白質,現已鑒定出來的分子伴侶主要屬于幾類高度保守的蛋白質家族,其成員廣泛分布于原核及真核細胞中。其中大部分成員屬于熱體克蛋白(heatshockprotein,Hsp),根據其結構與功能的差異,分子伴侶包括幾個結構上不相關的蛋白質家族:Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、SmallHsps(smHsp)、鈣聯接蛋白(Calnexin)、TCP-1環復合體(TCP-1containingringcomplex,TRiC)、核漿素(Nucleoplasmin)、輔助分子伴侶Co-chaperone(DnaJ、GroES、Cpn10)和折疊酶等。其中研究比較清楚的是Hsp70/DnaK和Hsp60/GroE系統,尤其對后者即伴侶因子的研究進展較快,已在Cell,Nature等重要雜志先后報道,本文綜述如下。2真核生物中的小體糖1,5-二磷酸羧化酶抑制劑清髓工酶的結構及分布伴侶因子是一種普遍存在的蛋白質家族,一般結構是由兩個圓環背靠背組成的一個大圓柱體,每個圓環是由具有ATP酶活性的分子量約60kD的亞基構成。圓柱體中央的空腔是蛋白質折疊的重要場所,它提供了底物蛋白折疊所需的封閉環境,參與協助其它蛋白質多肽的折疊修飾等。根據伴侶因子來源及同源性的特點可將其分為兩大組:第一組(GroupI)伴侶因子存在于細菌及真核生物中的內生同源細胞器(線粒體和葉綠素),成員包括細菌內的GroEL、真核生物線粒體中的Hsp60(Cpn60)以及葉綠體中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶結合蛋白(RubiscoBondingProtein)。第二組(GroupII)伴侶因子存在于古細菌及真核生物的胞質中,成員有古細菌胞質內的溫度傳感器(Thermosome)和嗜熱因子55(thermophilicfactor55,TF55),以及真核生物胞質內的含有TCP-1的伴侶因子(chaperonincontainingTCP-1,CCT),也稱為TCP-1環復合體(TCP-1containingringcomplex,TRiC)。2.1第一組離婚因素這一組伴侶因子中尤以對大腸桿菌中的GroEL的結構、功能研究較為詳細,促進了人們對伴侶因子的認識和了解。2.1.1groel亞單元的結構及其與合成肽的關系早在1978年,Georgopoulos等學者研究發現,大腸桿菌中的λ噬菌體生長時,必須有GroE的存在,GroE系統是由GroEL及其它的輔助分子伴侶GroES組成。GroEL蛋白是同型寡聚復合物,由14個相對分子量為57kD的亞基組成;GroES是由相對分子量為10kD的亞基組成的七聚體環,連在GroEL的末端。GroEL的電鏡圖像顯示其圓柱體狀的顆粒中有一個中央腔,腔內可以被底物多肽占據。Braig等用X-ray結構分析得到了GroEL更加清晰的圖像,證實GroEL分子類似一個直徑137,高146的圓筒(?=10-10m),它的14個亞基背靠背構成兩個圓環,兩個圓環圍繞形成兩個獨立的寬45空腔,此空腔作為多肽底物折疊的空間。每個GroEL亞單元可以被分成3個不同的區域:(1)赤道結構域(equatorialdomain),由第6～133和409～523氨基酸殘基構成,它組成圓筒的中央部分且主要為α螺旋,具有調節所有中間接觸及大部分內部接觸的作用。同時還含有面向中央腔的ATP結合位點。(2)頂端結構域(apicalregion),由第191～376氨基酸殘基構成,與赤道結構域不同,其構相變化不穩定。它位于GroEL圓筒的開口處,且含有GroES和多肽底物的結合位點。多肽結合在由兩個面向中央空腔的單環形成的疏水槽內,這與早前使用定點突變分析所得結構相吻合。(3)中間結構域(intermediatedomain),也被稱為鉸鏈結構域(hingedomain),由第134～190和第377～408氨基酸殘基構成,其作為分子鏈連接頂端結構域和赤道結構域,作用是傳導兩結構域間的變構信號,及建立核苷酸結合部與GroES/多肽結合部之間的緊密偶聯。輔助分子伴侶GroES是一個圓頂型的七聚體,直徑75,高30。它幾乎全部由β折疊構成,Landry等發現,天然的GroES有一個高度活動及趨向性的多肽袢環,袢環的活動性及趨向性隨GroEL/GroES復合體的形成而消失。對合成肽的研究還發現,袢環與GroEL上的一個發夾結構相結合,而此結合位點與底物結合位點是不同的。袢環的活動性及趨向性,可能使得它的七個部分更容易與GroEL的七個亞基同時結合,這樣可使每部分采取不同的排列,借此變構效應來調整GroEL/底物的親和力。GroES與GroEL的頂端結構域結合,且要求GroEL環上的氨基酸位點與ATP或ADP結合。GroES的袢環與GroEL的疏水肽溝槽結合并固定。2.1.2中間結構域和底物的變化GroE可以促進其它蛋白多肽的折疊,同時,GroE在蛋白質跨膜轉運和蛋白質插入E.coli細胞質膜過程中起重要作用。GroE是最早被研究,也是研究最詳細的伴侶因子,它已成為輔助蛋白折疊的模型。多年來,已有很多關于GroE結構和功能的研究結果,使得我們可以更好地理解分子伴侶工作的基本原理。GroEL與GroES、ATP等組成一個協助蛋白折疊的系統,其實質是給非天然多肽(nonnativepolypeptide)提供一個隔離的工作平臺,其工作過程是由ATP的結合與水解所驅動的分子伴侶構象變化的循環,此循環分三個步驟:(1)GroEL攝取多肽底物;(2)隨著GroEL與GroES及ATP的結合,底物被置于一個可以促進蛋白折疊的特殊微環境中;(3)隨著ATP的水解,多肽被重新釋放到溶液中。這三種功能狀態的轉變主要由ATP、GroES、底物與GroEL的結合而產生變構效應。GroEL與底物的結合,主要是頂端結構域與非天然構象底物蛋白的疏水性結合,引起顯著的構象改變,尤其是頂端結構域構象的改變(環向上、向外旋轉)使空腔直徑幾乎增大一倍,體積由原來的850003增大到1750003。隨后,GroEL中組成多肽結合位點的疏水殘基離開空腔表面,被空腔壁覆蓋,這時空腔內部就成為一個親水表面。隨后,GroES阻斷空腔的出口,這時,空腔便由疏水多肽的受體成為蛋白折疊的閉合微環境。最后,ATP的水解導致GroES的解離,使底物蛋白釋放出來。如果此底物蛋白并未達到天然構象,它還可以進人另一次循環。對分子機制的研究發現,中間結構域存在順式、反式兩種構象,其構象變化在與GroES的相互作用、結合ATP并將其水解以及對底物的折疊和解折疊中起到重要作用。GroEL是一類泛宿主性的伴侶因子,它可與許多底物蛋白相作用,據估算有300多種大小不一的蛋白多肽底物。其中多數參與重要物質的代謝,包括氨基酸代謝(腺苷甲硫氨酸合成酶),糖代謝(磷酸轉乙酰酶),嘌呤嘧啶生物合成等等。另外在轉錄、翻譯機器和酶的主要成分,如RNA聚合酶、核糖體蛋白、tRNA合成酶,等等,這些蛋白中大約有1/3結構不穩定,常需反復進入GroEL,以維持其正確構象。多肽與GroEL結合最初是基于疏水作用,這已由結合反應的熱力學分析證明,同時靜電的相互作用也可能起到一定的作用。與正確折疊的蛋白不同,未折疊或部分折疊的多肽常常會暴露其疏水表面,這些疏水表面會非特異的結合形成聚合物。所以蛋白多肽折疊不佳會導致蛋白質聚集。無生理作用的蛋白質大量聚集后,可以被溶酶體水解清除,但若過度聚集超出溶酶體的水解能力,可能會導致疾病的發生。GroE在蛋白質跨膜轉運和蛋白質插入E.coli細胞質膜過程中起重要作用。Phillips等的實驗表明,在GroEL功能缺陷的E.coli菌株中,分泌蛋白的輸出受到損傷。根據熒光印跡結果分析,GroEL的膜靶蛋白是SecA,后者是轉運機制中的一個中心蛋白,它與SecY形成蛋白質傳導膜通道。GroEL與膜結合的SecA相互作用同某些生理活動是相關的,如GroEL能與新合成的分泌蛋白或膜蛋白相互作用,促進蛋白質跨膜轉運或促進其插入細胞質膜中。GroEL作為分子伴侶參與蛋白質跨膜轉運,可能是通過維持SecA在各種條件下的功能活性構象來實現的。當然,SecA并不是GroEL識別的唯一膜成分,別的未鑒定出來的蛋白質也可能與GroEL有作用。另外,在一些情況下,GroEL可以通過刺激SecA從膜中釋放,來調節SecA與膜結合的周期。2.2cct和trc通過實驗整合引物來表達第二組伴侶因子存在于古細菌及真核生物的胞質中,這類伴侶因子與第一組伴侶因子僅有很低的序列同源性,其結構及組分有一定的異質性。這類伴侶因子可能是由1～3種不同蛋白組成的八聚體或九聚體。其中最為復雜的就是真核生物胞質內伴侶因子,即前述的包含TCP-1的伴侶因子(CCT或TRiC)。最早發現此蛋白時,它的序列與真核細胞的T-復合體多肽-1(t-complexpolypeptide1,TCP-1)十分相近,隨后TCP-1相關基因在真核細胞被發現,且證明其有分子伴侶功能,故現今仍沿用CCT和TRiC。而古細菌中的伴侶因子被稱為溫度傳感器(Thermosome),是因為它們最早被發現存在于嗜熱類生物。第二組伴侶因子的八圓環結構與第一組伴侶因子GroEL的七圓環在形態上有明顯差異,同時二者功能上亦有差異。如上所述,GroEL是一類泛宿主性的伴侶因子,它可與許多底物蛋白相作用,而CCT具有一定的選擇性,且有對細胞支架蛋白的傾向性,如對肌動蛋白和微管蛋白的作用。除此以外,CCT的作用機制與GroEL不同,因為其缺少像GroES一樣幫助伴侶因子腔內折疊的輔助因子。下面以CCT為代表闡述第二組伴侶因子的結構和功能。2.2.1cct為雙環復合體的一般形態伴侶因子分子較大,便于在電鏡下觀察,同時可以使用X-ray結晶成像術得到更加清晰的結構分析。電鏡顯示,CCT是一種典型的單體不同的雙環復合體,復合體形狀如桶,且有圓頂狀的末端。CCT也是由兩個圓環背靠背組成,每個環由八個不同的同源亞基構成(30%的同源性),亞基分別命名為CCTα,β,γ,δ,ε,ζ,η和θ亞基(酵母中稱為CCT1～8),亞基在環內的排列是固定的。2.2.2其他分子中蛋白的缺失的功能早期的遺傳學實驗表明,TCP-1與細胞骨架,尤其是微管系統有關。近幾年的研究證實,包括TCP-1在內的伴侶因子可輔助新合成的肌動蛋白和微管蛋白的折疊。Brown等在對中心體研究中證明Hsp73和TCP-1是中心體的組成成分,同時發現抗TCP-1抗體阻斷微管從中心體的再生,并證明了TCP-1作為分子伴侶輔助微管蛋白的正確折疊與裝配。這種伴侶因子可以直接與細胞骨架蛋白如α、β、γ微管蛋白、肌動蛋白及角蛋白接連,另外它還是中心體的組成部分,與微管的核化有關,只有古細菌中的成員有應激誘導性。3可能的隨機性因素的臨床意義3.1cpn60與胰腺疾病的關系Velez-Granell等發現,伴侶因子60(Cpn60)及其輔助因子10(Cpn10)在胰腺腺泡細胞中的分布與胰酶的一致,而且沿胰酶合成分泌的途徑,即從粗面內質網(roughendoplasmicreticulum,RER)、高爾基體(Golgi,G)到酶原顆粒(zymogengranule,ZG)(RER-G-ZG),濃度不斷上升,最終隨胰酶排入腺泡管。這種Cpn60與胰酶共分布的現象提示Cpn60在胰腺中參與了胰酶蛋白合成分泌的過程。這一假說后來得到了有力的證明,Bendayan等用蛋白金標免疫細胞化學技術(proteinA-goldimmunocytochemistrytechnique)看到,沿胰酶合成分泌的途徑,Cpn60與胰腺的脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶在量上有明顯的相關性,且在分離的胰腺酶原顆粒中加入Cpn60抗體,上述消化酶與Cpn60同時被沉淀,表明Cpn60與其相伴行。由此聯想到Cpn60與一些胰酶異常的疾病,如急性胰腺炎AP、糖尿病等發生發展的可能的關系。急性胰腺炎可由不同原因引起,而每一因素通過不同的機制引起胰腺腺泡細胞內胰蛋白酶原激活,進而損傷腺泡細胞及整個胰腺。已知胰腺蛋白酶過早激活引起胰腺自身消化性損傷是胰腺炎發生的一個重要事件,但其發生的機制尚不清楚。Lee等使用水浸潤應激(water-immersionstress)大鼠,誘導其Cpn60高表達,可以防止腺泡細胞內的胰蛋白酶原的激活,從而減輕由雨蛙肽(caeruline)誘導的急性胰腺炎的嚴重程度。其他類似研究報道,熱、酸、滲透壓改變等應激狀況,或休克等均可誘導Cpn60的轉錄及表達增加,這被認為是一種適應性細胞保護(adaptivecytoprotection)。在胰管逆行注射膽鹽誘導的急性胰腺炎大鼠模型,胰腺腺泡中的淀粉酶,胰蛋白酶,脂肪酶含量持續在高水平,作為適應性細胞保護,Cpn60的含量應該上升,但有實驗看到,胰腺腺泡細胞中Cpn60水平反而降低,尤以酶原顆粒中的更為明顯,認為與胰酶伴行的蛋白伴侶相對不足,可能引起胰酶堆積于腺泡細胞,促使其胞內激活的發生。另外,急性胰腺炎時腺泡細胞內溶酶體增多、分布異常,加上胰脂肪酶以及蛋白酶含量增多,Cpn60含量減少,這些異常變化可能是胰酶胞內激活的