腫瘤淋巴道轉移的研究進展

腫瘤主要通過血道和淋巴路形成遠處轉移，這是影響治療效果和患者死亡的重要原因。因此,同時阻斷血道和淋巴道轉移是控制腫瘤轉移最為有效的策略。既往的研究主要側重于腫瘤血道轉移、血管生成及抗血管生成治療方面,取得了一定的進展,但抗血管生成治療并未獲得抗腫瘤轉移的預期效果,其原因就在于淋巴管道系統與血管系統形成一個互為交通的網絡結構,腫瘤細胞可在兩個管道系統之間自由進出,單純阻斷某一條轉移途徑并不能很好地控制腫瘤細胞遠處轉移。長期以來由于缺乏對淋巴內皮細胞特異性標志物的認識,因而無法對腫瘤淋巴道轉移的具體過程及其轉移機制進行深入的研究。臨床和病理研究已經證實淋巴道轉移是大多數實體瘤播散的早期事件,是腫瘤細胞播散的重要途徑之一。相對于血管系統而言,毛細淋巴管的腔徑比毛細血管粗,而且管壁較薄、流速緩慢、剪切力低、淋巴與組織間液的組成基本相同,因而更有利于腫瘤細胞的播散、存活及轉移。腫瘤淋巴管生成(lymphangiogenesis)是指在腫瘤原位形成新的毛細淋巴管。由于新生淋巴管僅由單層淋巴內皮細胞組成、基底膜不完整、管壁薄,因而腫瘤細胞便于進入淋巴管道,進而形成淋巴結轉移和遠處轉移。1腫瘤組織中的腫瘤細胞管和淋巴內皮細胞的表達在發現淋巴內皮細胞特異性分子標志之前,淋巴管與血管的鑒別主要依靠某些間接手段:毛細淋巴管具有攝取某些活性染料和大分子量物質的能力(如Evans藍、Trypan藍、Patent藍、熒光標記示蹤劑等),缺乏基底膜的某些成分(laminin,Ⅳ型、ⅩⅧ型膠原),CD31+內皮細胞PAL-E染色陰性,5′-核苷酶呈強陽性等。最近幾年來,淋巴內皮細胞的多種分子標志相繼被發現,包括VEGFR-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3)、LYVE-1(lymphaticvesselendothelialhyaluronanreceptor-1)、Podoplanin、Prox-1(prosperorelatedhomoboxprotein1)等,運用分子技術的手段已能純化培養淋巴內皮細胞和血管內皮細胞,極大地促進了淋巴內皮細胞的深入研究。1.1VEGFR-3淋巴內皮細胞上第一個被克隆的分子標志就是VEGFR-3(也稱為fms-liketyrosinekinase4,FLT4)。VEGFR-3基因定位于5q33-q35,其編碼產物在人類有兩種剪接異構體,長異構體C末端有額外65個氨基酸殘基,在組織中檢測到的主要類型為長異構體,參與淋巴內皮細胞活化后的信號傳導。糖基化VEGFR-3分子量為195ku,胞外第5個Ig結構域被蛋白酶分解為分子量分別為120ku和75ku的兩條鏈,鏈間以二硫鍵連接。VEGFR-3在胚胎形成過程中對于心血管的發育是必需的,成年后該受體主要表達于淋巴內皮細胞上,腫瘤血管內皮細胞也有極少量表達。VEGF-C和VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的兩種特異性配體,二聚化的VEGF-C/VEGF-D與VEGFR-3同源二聚體結合后可誘導淋巴管生成。1.2LYVE-1LYVE-1是淋巴內皮細胞特異性分子標志之一,目前已知的配體是透明質酸。LYVE-1與CD44糖蛋白同源,在淋巴管腔面和外表面有同等表達,其生理功能是將透明質酸通過淋巴內皮轉運至淋巴。LYVE-1在腫瘤淋巴道轉移中的作用尚不清楚。最近發現該受體也表達于肝血竇內皮細胞和腎、腎上腺、胰、甲狀腺上皮細胞上。1.3PodoplaninPodoplanin是最早發現存在于腎小球足突細胞膜上的一種粘蛋白,控制著足突細胞的形狀。Podoplanin和VEGFR-3共表達于小淋巴管內皮細胞上,是淋巴內皮有用的分子標志之一,但在血管腫瘤、成骨細胞和Ⅱ型肺泡細胞上也有表達。Podoplanin在淋巴內皮細胞中的功能尚不清楚。1.4Prox-1Prox-1是一種轉錄因子,在多種細胞上均有表達,但在內皮細胞中僅在正常或腫瘤組織的淋巴內皮細胞上可檢測到。Prox-1可能調控著淋巴內皮細胞的分化或遷移,在胚胎淋巴管發育中具有重要作用。缺乏Prox-1的小嬰兒常由于淋巴管芽生和分化缺陷而死亡。1.5其它分子標志淋巴內皮細胞的其它分子標志包括整合素α9β1、Net、Lyp-1、neuropilin-2(NRP-2)、desmoplakin、β趨化因子受體D6等,它們大多是淋巴管發育過程中的關鍵分子。需要指出的是,這些分子均不是淋巴內皮細胞完全意義上的特異性標志物。2vegf-c或vegf-d對vegf-d的誘導VEGF-C和VEGF-D是淋巴管生成的兩個重要因子,它們是VEGF家族中的成員。哺乳動物VEGF家族包括VEGF(也稱作VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF(placentagrowthfactor),均具有VEGF同源結構域(VEGFhomologydomain,VHD)保守序列,但VEGF-C/VEGF-D在結構上與其它成員有所不同,其N、C末端分別有一段前肽序列,前肽的蛋白酶解過程影響著VEGF-C/VEGF-D的生物活性,完全酶解的VEGF-C/VEGF-D與其特異性受體VEGFR-2或VEGFR-3的親和力最強。VEGF、VEGF-B和PlGF參與血管通透性控制和誘導血管生成,而VEGF-C/VEGF-D不但可誘導血管生成,還能誘導淋巴管生成。VEGF-C/VEGF-D是誘導血管生成還是誘導淋巴管生成受許多因素的影響,其中VEGFR-2或VEGFR-3的表達水平可能是最重要的因素。VEGF-C/VEGF-D誘導淋巴管生成的作用已在轉基因小鼠或其它動物模型上得到證實。Jeltsch等將VEGF-CcDNA插入細胞角蛋白14(K14)啟動子下游(K14啟動子靶向表達于鱗狀上皮的基底細胞),然后轉入小鼠體內,在轉基因小鼠皮膚的表皮與內皮細胞層之間觀察到較大的、擴張的管狀結構,經電鏡和免疫組化染色證實為新生的淋巴管,淋巴內皮細胞增生活躍,淋巴管寬度約2倍于對照組,表明VEGF-C高表達可誘導淋巴管生成。Veikkola等在VEGF-C156S(第156位半胱氨酸殘基突變為絲氨酸,只能激活VEGFR-3,而不能使VEGFR-2活化)和VEGF-D轉基因小鼠的研究中也表明,VEGF-C156S和VEGF-D均可促進皮膚淋巴管增殖、管腔變大,對其功能的研究發現增生淋巴管在對鐵的轉運和對液體的吸收上不受明顯影響。提示高表達VEGF-C156S或VEGF-D可誘導淋巴管生成,而且新生的淋巴管與正常淋巴管具有相似的功能。本研究更進一步證實通過VEGFR-3信號傳導足以誘導淋巴管生成,因而奠定了VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信號傳導通路在調控淋巴管生成過程中的重要地位。VEGFR-3二聚體胞外區第二個Ig結構域是其特異性配體VEGF-C或VEGF-D的結合部位,當逆向排列的VEGF-C或VEGF-D同源二聚體與VEGFR-3結合后,迅速使VEGFR-3活化(磷酸化),并引起下游分子Shc、Grb2磷酸化,通過MAPK信號途徑促使淋巴內皮細胞增生、遷移和存活,從而形成新生的毛細淋巴管。VEGFR-3有兩種異構體,在信號傳導方面存在差異,僅有VEGFR-3長異構體能在軟瓊脂上介導細胞生長和在裸小鼠中誘導腫瘤形成。在VEGFR-3的C末端Tyr1333、Tyr1337和Tyr1363存在額外的自磷酸化位點,所以它本身顯示較高的自磷酸化水平。而Shc可能是VEGFR-3活性的負向調控因子,因為Shc磷酸化位點發生突變后可導致VEGFR-3轉化活性增強。3腫瘤淋巴管生成與肺胰腺組織及血管內皮相關指標的關系腫瘤淋巴管生成增加了淋巴道轉移發生的機會,腫瘤細胞通過粘附、遷移等過程侵入毛細淋巴管,然后聚集形成瘤栓進入下一級淋巴管和局部淋巴結,形成淋巴道轉移。在臨床資料方面,已有證據顯示腫瘤淋巴管生成可促進淋巴道的轉移。Amioka等在139例粘膜下侵襲性胃癌的研究中發現腫瘤組織VEGF-C表達與腫瘤浸潤深度、淋巴管受侵以及淋巴結轉移明顯相關;同時在12例胃癌與正常胃粘膜配對研究中發現胃癌組織中VEGF-C、VEGFR-3mRNA明顯高于對照組,免疫組化染色和原位雜交結果均顯示VEGF-C在胃癌組織中有較高表達,單因素和多因素分析發現VEGF-C的陽性表達、淋巴管浸潤與淋巴結轉移明顯相關,VEGF-C陽性組微血管密度(MVD)明顯高于陰性組,其研究結果提示VEGF-C高表達可促進胃癌的淋巴道轉移。Munoz-Guerra等采用抗PA2.26(即Podoplanin)的多克隆抗體對61例Ⅰ、Ⅱ期口腔鱗癌患者進行檢測,發現33名患者有瘤內淋巴管生成,淋巴管密度明顯較正常粘膜組織增高,而瘤內淋巴管生成與腫瘤的局部復發明顯相關(P=0.02),單因素分析發現瘤內淋巴管生成并不影響患者總生存期,但與無瘤生存期明顯相關,多因素分析發現瘤內淋巴管生成是影響無瘤生存期的唯一獨立因子,表明瘤內淋巴管生成與早期口腔癌的局部復發有關,并是預測尚無淋巴結轉移的口腔癌患者預后的有用指標。Li等在76例非小細胞肺癌(NSCLC)的研究中發現VEGF-C的表達與VEGFR-3的表達呈正相關,而與腫瘤細胞的分化程度呈負相關;VEGF-C和VEGFR-3可使腫瘤組織中的淋巴管密度增加,并促進淋巴管浸潤和局部淋巴結轉移;VEGF-C陽性表達患者的預后明顯較陰性者差(5年生存率分別為12.72%和42.75%)。其研究結果表明VEGF-C和VEGFR-3可促進NSCLC淋巴管生成,參與了肺癌的發生和發展,而VEGF-C可能是患者預后不良的有用指標之一。Su等在59例肺腺癌的研究中發現環氧化酶-2(COX-2)的表達水平與VEGF-C的表達、腫瘤組織中的淋巴管密度有密切關系,提示COX-2可通過上調VEGF-C的表達促進腫瘤淋巴管生成。我們在食管鱗癌組織的檢測中發現VEGFR-3陽性淋巴管較正常食管粘膜組織明顯增多,VEGFR-3mRNA的表達與食管癌臨床分期有密切關系,而與腫瘤分級無明顯關系,淋巴結轉移組VEGFR-3+淋巴管數目明顯高于無轉移組(P<0.01),提示淋巴管生成可促進食管鱗癌的淋巴結轉移(待發表資料)。在頭頸部鱗癌和原發性黑色素瘤的研究中也發現存在瘤內淋巴管生成。在動物模型上,利用轉基因技術使腫瘤細胞高表達VEGF-C或VEGF-D,發現VEGF-C/VEGF-D可誘導腫瘤淋巴管生成,促進淋巴結轉移。Skobe等首先將綠色熒光蛋白(GFP)轉入人MDA-MB-435乳腺癌細胞以便于觀察腫瘤微轉移,再將VEGF-CcDNA導入MDA-MB-435/GFP細胞,獲得穩定表達VEGF-C和GFP的細胞株,然后原位移植到裸小鼠雙側乳腺頰脂墊,12周后處死小鼠進行檢測,觀察VEGF-C對腫瘤淋巴管生成、淋巴結轉移及肺轉移的影響。結果顯示,表達VEGF-C組瘤周淋巴管明顯擴張,且有很多淋巴管侵入瘤體內,甚至深達腫瘤中心,管腔多不連續,腔內多含有腫瘤細胞,淋巴內皮細胞增生活躍,腋窩淋巴結內可觀察到轉移的腫瘤細胞,肺部轉移灶明顯增多、增大。研究結果表明VEGF-C可促進乳腺癌淋巴管生成,增加局部淋巴結轉移和遠處(肺)轉移的發生。Mattila等在侵襲性極差的人MCF-7乳腺癌細胞內轉入VEGF-C基因,然后原位移植于裸小鼠,結果發現VEGF-C組小鼠瘤內、瘤周LYVE-1+或VEGFR-3+,淋巴管數目較對照組均明顯增多,在兩次不同的實驗中觀察到VEGF-C組局部淋巴結轉移率分別為75%(6/8)和62%(5/8),而對照組未發現局部淋巴結轉移(0/8)。研究結果也提示VEGF-C可刺激腫瘤淋巴管生成,促進淋巴結轉移。人乳腺癌293EBNA細胞不表達VEGF、VEGF-C或VEGF-D,Stacker等將VEGF-D基因轉入該腫瘤細胞,然后原位移植到SCID/NOD小鼠,結果發現轉基因組瘤內淋巴管數目明顯增多,形成大量的管狀結構,多呈簇狀,瘤周也有較多的淋巴管,而對照組僅在腫瘤包膜結締組織有少量LYVE-1+染色的淋巴管,轉基因組局部淋巴結轉移發生率為61%(14/23),明顯高于對照組(0/14)。表明VEGF-D也可誘導腫瘤淋巴管生成,促進淋巴結轉移。腫瘤新生的淋巴管雖然是淋巴道轉移所必需的條件之一,但僅有淋巴管生成尚不足以導致淋巴結轉移。He等發現高表達VEGF-C的人肺癌N15細胞(侵襲性差)可誘導瘤內和瘤周淋巴管生成,但并不增加局部淋巴結轉移,表明腫瘤細胞惡性表型的轉變是一個復雜的過程,可能涉及多種基因的參與。4腫瘤淋巴道轉移抑制劑大量的研究表明VEGF-C/VEGF-D可通過活化VEGFR-3,刺激腫瘤淋巴內皮細胞增殖、遷移,促進淋巴管生成,從而增加腫瘤淋巴道轉移的發生。因此,阻斷淋巴管生成是抑制腫瘤淋巴道轉移的有效方法。抗腫瘤淋巴管生成治療已在動物模型上成功開展,并取得了抑制腫瘤淋巴道轉移的作用。前文已述及的淋巴內皮細胞分子標志均可作為抗淋巴管生成治療的可能靶標,其它分子靶點尚包括VEGF-C、VEGF-D、Ang-2(angiopoietin-2)、FOXC2等。鑒于VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信號傳導在誘導淋巴管生成過程中的重要作用,阻斷該信號通路是抗淋巴管生成治療目前最常采用的策略。迄今用于阻斷VEGF-C或VEGF-D與VEGFR-3相互作用的主要方法包括VEGF-C、VEGF-D或VEGFR-3的功能阻斷性抗體,可溶性VEGFR-3-Ig,小分子肽抑制劑,前蛋白轉化酶(proproteinconvertase,PCs)抑制劑等。4.1vegf-d在小鼠體內的原位分離和誘導VEGF-C、VEGF-D或VEGFR-3的功能阻斷性抗體可特異性阻斷VEGF-C或VEGF-D與其受體VEGFR-3的結合,使VEGFR-3不能被活化,故淋巴管增殖、遷移所需的信號無法進行傳導,從而抑制淋巴管生成。Achen等根據VEGF-D的同源結構域在小鼠體內制備人的單克隆抗體,該抗體可特異性阻斷VEGF-D與VEGFR-2或VEGFR-3的相互作用,從而抑制人微血管內皮細胞增殖。Stacker等將表達VEGF-D的293EBNA乳腺癌細胞原位移植于SCID/NOD小鼠,然后注射VEGF-D單克隆抗體VD1,26天后發現VD1注射組小鼠不出現腋窩淋巴結轉移(0/7),而對照組局部淋巴結轉移率為61%(14/23),注射無關性單抗LMM774后并不能抑制局部淋巴結轉移(60%,6/10),表明VEGF-D功能阻斷性抗體具有抗腫瘤淋巴管生成的作用。成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)-2可同時誘導血管生成和淋巴管生成,在小鼠角膜淋巴管生成和血管生成模型上,Kubo等發現VEGFR-3功能阻斷性抗體可完全抑制FGF-2誘導的淋巴管生成,但對血管生成無明顯影響。4.2vegfr-3-ig在小鼠體內的生長和活檢運用分子生物學方法,將包括與其配體結合域在內的VEGFR-3胞外區基因(通常是Ig1-3結構域)與IgGFc基因偶聯,轉入合適的載體,然后轉染腫瘤細胞使其表達VEGFR-3-Ig,或在某種表達系統上使其直接表達VEGFR-3-Ig蛋白。VEGFR-3-Ig雖然可與VEGF-C或VEGF-D結合,但無法進行下游的信號傳導(被稱作VEGF-C/VEGF-DTrap),從而達到抑制淋巴管生成的作用。Makinen等將VEGFR-3胞外區Ig1-3結構域基因與人IgG1Fc基因連接,克隆到K14表達載體,然后將其注射到受精小鼠的卵細胞內,獲得表達K14-VEGFR-3-Ig的小鼠,觀察VEGFR-3-Ig對小鼠皮膚淋巴管生成的影響。結果發現轉基因組小鼠皮下淋巴管缺乏,已發育的淋巴管在胚胎期第18.5天完全消退,某些內臟器官(心、盲腸、食管、腸系膜、膈)的淋巴管發育受到抑制,出現不同程度的水腫。研究結果表明VEGFR-3-Ig可抑制淋巴管生成。He等將高轉移性人肺癌LNM35細胞移植到SCID小鼠皮下,觀察VEGFR-3-Ig基因表達或可溶性VEGFR-3-Ig蛋白對淋巴管生成、淋巴結轉移和肺轉移的影響。結果發現,VEGFR-3-Ig基因表達可明顯抑制腫瘤淋巴管生成,淋巴管密度顯著降低(相同放大倍數下每格的淋巴管數目4.1對15.3),腋窩淋巴結體積明顯減小(14.6mm3對71.6mm3),在所有的腋窩淋巴結中發生轉移的比例較低(4/12對12/12),但對肺部轉移并無明顯影響;而可溶性VEGFR-3-Ig蛋白同樣可抑制腫瘤淋巴管生成,減少腋窩淋巴結轉移的發生(0/14對6/7),在對腋窩淋巴結的檢查中發現:可溶性VEGFR-3-Ig蛋白組28個淋巴結均無腫瘤細胞,平均淋巴結體積為3.2mm3,對照組14個淋巴結中11個含有轉移的腫瘤細胞,平均淋巴結體積為74.26mm3,差異非常顯著。可溶性VEGFR-3-Ig蛋白同樣不影響遠處(肺)轉移。Karpanen等在MCF-7乳腺癌原位移植模型上也觀察到可溶性VEGFR-3-Ig蛋白可抑制腫瘤淋巴管生成。4.3單次給藥后vegfr-3對vegfr-3的抑制作用VEGFR-3和VEGFR-2均具有酪氨酸激酶活性,已證實酪氨酸激酶抑制劑SU54