不同蛋白水解條件對宣漢黃牛瘤胃固相粘附蛋白分解菌數(shù)量的影響

中國的蛋白素資源正在供應(yīng)不足。國家飼料工業(yè)辦公室預(yù)估,2020年我國蛋白質(zhì)飼料的需要量達(dá)到0.72億噸,而資源供給量僅為0.24億噸,供需缺口達(dá)到0.48億噸。高效合理的利用蛋白飼料資源可在一定程度上緩解蛋白飼料資源供不應(yīng)求的局面。反芻動物的日糧主要依靠瘤胃微生物來消化,嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌、棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃中主要的3大蛋白降解菌,牛鏈球菌也具有高蛋白降解酶活性。充分利用這些瘤胃微生物,是調(diào)控反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)、節(jié)約蛋白質(zhì)飼料、緩解蛋白質(zhì)資源短缺的重要途徑之一。目前對瘤胃微生物的研究主要集中在精粗比和粗飼料方面,關(guān)于特定蛋白質(zhì)飼料對瘤胃蛋白分解菌數(shù)量的影響并不十分清楚;且大多試驗動物都是奶牛和羊,對四川省主要的肉牛品種宣漢黃牛的研究未見報道。瘤胃微生物種群在瘤胃內(nèi)主要以3種方式存在:一是存在于瘤胃液中;二是附著于瘤胃內(nèi)壁上;三是黏附于飼料顆粒上。大量研究表明瘤胃固相中的微生物數(shù)量高于瘤胃液中的微生物數(shù)量,是瘤胃中主要的功能微生物。因此研究不同蛋白質(zhì)飼料對宣漢黃牛瘤胃固相粘附蛋白分解菌數(shù)量的影響顯得非常重要。豆粕、菜粕和棉粕是我國產(chǎn)量最高、經(jīng)常使用的主要優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料。本試驗在對這3種蛋白質(zhì)飼料進(jìn)行了營養(yǎng)價值評定的基礎(chǔ)上,研究宣漢黃牛采食不同蛋白質(zhì)飼料后其瘤胃蛋白分解菌數(shù)量的變化,旨在為更好的調(diào)控瘤胃微生態(tài),更合理地利用蛋白質(zhì)飼料資源配制肉牛飼料提供一定的參考。1材料和方法1.1dnaloadingbroadingbroadingbroading,u2004菜粕、豆粕、棉粕及其他飼糧成分來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗基地。TIANampStoolDNAKit,RNaseA(100mg·mL-1),6×DNAloadingbuffer,DNAMarker,DNase/RNase-freeddH2O,SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)均購自TIANGEN(北京)公司。熒光定量PCR儀(美國Bio-radCFX96TM)、核酸蛋白檢測儀(美國BeckmanDU-800)和凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene)。1.2飼糧、飼料和樣品采集選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗基地4頭體況良好,年齡體重接近,安裝有永久性瘤胃瘺管的去勢宣漢黃牛。采用4×4的拉丁方設(shè)計,共4期,每期10d(預(yù)試7d,采樣3d)。每天定時定量飼喂2次(07:00和17:00),拴系飼養(yǎng),自由飲水?；A(chǔ)飼糧參考中國肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004版)設(shè)計,1.3倍維持需要,精粗比為4∶6,粗料為稻草、苜蓿草粉和白酒糟。試驗組飼糧(豆粕組SBM、菜粕組RSM、棉粕組CSM)分別用豆粕、菜籽粕和棉籽粕替換基礎(chǔ)飼糧(CN)精料的15%,試驗飼糧一次性備齊。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。采樣期時,連續(xù)3d通過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物,在每頭牛的瘤胃內(nèi)分別取上、下、左、右、中5個位置的瘤胃內(nèi)容物約200g,并用4層紗布過濾分離出固、液相食糜,固相樣品裝入無菌封口袋中。樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?d采樣時間分別為第1天08:00和14:00,第2天10:00和16:00,第3天12:00,即飼喂后1、3、5、7和9h。1.3pcr檢測固相內(nèi)酰胺酶活性將瘤胃固相樣品4℃解凍后,參考S.Kang等和R.Laure等的方法洗脫固相粘附微生物:稱取1g樣品于10mL離心管中,加入5mLPBS懸浮,輕搖30s,350g室溫離心15min,取上清于一新的離心管(松散粘附的固相微生物)。再向殘渣部分加入4mL厭氧條件下制備的0.15%(v/v)Tween-80,充分混勻后在冰上放置2.5h,350g室溫離心15min,取上清(緊密粘附的固相微生物)于前一新的離心管,10000g4℃離心20min,去上清留沉淀,沉淀即為固相粘附微生物菌體。然后使用TIANampStoolDNAKit試劑盒稍加修改提取微生物總DNA。修改地方:(1)95℃孵育10min;(2)加GB前先加入5μLRNaseA,混勻后37℃水浴30min。然后加入15μLProteinaseK,混勻56℃水浴1h(每20min輕輕顛倒混勻)。采用核酸蛋白濃度儀測定提取的DNA濃度(ng·μL-1)及260nn/280nm的OD比值。于-20℃保存。采用PCR技術(shù)測定各組飼喂后1、3、5、7和9h時宣漢黃牛瘤胃固相粘附蛋白分解菌相對于瘤胃總菌16SrDNA的含量。引物序列見表2,引物由上海華大生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系為15μL:2×SuperRealPreMixPlus7.5μL,上、下游引物(10μmol·L-1)各0.45μL,DNA溶液0.6μL,RNase-freeddH2O6μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性15min;95℃變性10s,相應(yīng)的退火溫度30s,共40個循環(huán)。自動檢測熒光強(qiáng)度。擴(kuò)增反應(yīng)的特異性通過對PCR終產(chǎn)物制作熔解曲線來確定,方法:從65℃升溫到95℃,每熔10s升高1℃,儀器自動繪制熔解曲線。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析由公式:計算各菌相對于瘤胃總菌16SrDNA的含量。試驗結(jié)果用Excel2007進(jìn)行預(yù)處理,用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏多重比較檢驗,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著)。2結(jié)果2.1pcr擴(kuò)增檢測dna提取的DNAOD260nm/OD280nm值在1.8~2.0,說明得到的DNA能夠很好的應(yīng)用于后面的PCR擴(kuò)增試驗。各微生物PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示,擴(kuò)增條帶清晰且無拖帶現(xiàn)象,擴(kuò)增片段長度與文獻(xiàn)報道基本一致。說明所采用的引物有很高的特異性,擴(kuò)增體系沒有被污染,擴(kuò)增條件和參數(shù)適宜。2.2棉粕和粕組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量的比較表1如表3,各組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量變化趨勢相似,均為先升高后下降再升高。基礎(chǔ)組、菜粕組、豆粕組和棉粕組分別在采食后3、3、9和9h達(dá)到最大值。采食后1h,菜粕組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量顯著高于棉粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05),高出豆粕組0.17%(P>0.05)。3h時菜粕組顯著高于其余3組(P<0.05)。5和7h時則以豆粕組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量最高,顯著高于其余3組(P<0.05)。9h時,棉粕組和豆粕組顯著高于菜粕組(P<0.05),極顯著高于基礎(chǔ)組(P<0.01)。以平均值來看,豆粕組和菜粕組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量相近,顯著高于棉粕組(P<0.05),極顯著高于基礎(chǔ)組(P<0.01)。2.3各組溶纖維丁酸弧菌的比較豆粕組、棉粕組和基礎(chǔ)組這3組溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量都呈現(xiàn)出先升高后下降再升高的趨勢,而菜粕組則與之相反,且這3組溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量均在9h時達(dá)到最大值,菜粕組則在7h時已達(dá)到,如表3。1h時,豆粕組溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量顯著低于其余3組(P<0.05)。3h時各處理組均顯著低于基礎(chǔ)組(P<0.05)。5h時菜粕組顯著高于其余3組(P<0.05)。7h時菜粕組和棉粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。9h時棉粕組和基礎(chǔ)組顯著高于豆粕組(P<0.05),極顯著高于菜粕組(P<0.01)。以各組平均值來看,豆粕組溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量最低(P<0.05)。2.4棲瘤胃普雷沃氏菌/稻蝦門氏菌中棉粕和菜粕的變化由表3來看,各組棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量變化趨勢相似,均為先升高再下降,菜粕組和棉粕組均在7h時達(dá)到最大值,豆粕組在5h時達(dá)到最大值。在采食后1h各組對棲瘤胃普雷沃氏菌的影響差異不顯著(P>0.05)。3h時各處理組均顯著低于基礎(chǔ)組(P<0.05),棉粕組與豆粕組差異不顯著(P>0.05),但與菜粕組差異顯著(P<0.05)。5h時豆粕組和棉粕組顯著高于菜粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。7h時棉粕組棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量顯著高于菜粕組(P<0.05),極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01),菜粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。9h時,仍然是棉粕組最高,顯著高于豆粕組(P<0.05),極顯著高于菜粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01)。從平均值來看,棉粕組棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量最高,顯著高于豆粕組(P<0.05),極顯著高于菜粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01),豆粕組顯著高于菜粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。2.5各組大鼠棉粕和棉粕率的比較如表3,各組牛鏈球菌的數(shù)量變化趨勢沒有明顯規(guī)律。除1和5h外,其余各時間點均是棉粕組顯著高于其余各組(P<0.05)。1h時菜粕組和棉粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。5h時棉粕組和基礎(chǔ)組顯著高于菜粕組和豆粕組(P<0.05)。以平均值來看,棉粕組顯著高于菜粕組(P<0.05),極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01)。3蛋白質(zhì)對瘤胃微生物的影響瘤胃微生物的生長取決于以肽、氨基酸和氨形式存在的氮的可利用程度。除主要的纖維降解菌外,多數(shù)瘤胃細(xì)菌都具有蛋白酶活性。嗜淀粉瘤胃桿菌是目前已知的蛋白降解活性最高的菌株之一,溶纖維丁酸弧菌是分離自動物的最主要的蛋白分解菌,棲瘤胃普雷沃氏菌可能是瘤胃中數(shù)量最多的蛋白降解菌,這3種是瘤胃中主要的3大蛋白降解菌。G.T.Attwood等發(fā)現(xiàn),牛鏈球菌也具有高蛋白降解酶活性,但在瘤胃中的數(shù)量很少。M.Devant等認(rèn)為蛋白質(zhì)的來源、結(jié)構(gòu)和加工等都可能影響其瘤胃降解,進(jìn)而影響瘤胃微生物。不同的飼料蛋白質(zhì)可能由于其粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)或NH3-N等比例的不同,而引起微生物區(qū)系的變化。王夢芝等運用PCR-SSCP技術(shù)研究體外和體內(nèi)不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃微生物群體結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,蛋白質(zhì)源對瘤胃細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)有顯著影響。許曾曾體外試驗表明,不同蛋白來源的處理間瘤胃微生物發(fā)酵模式發(fā)生了顯著變化,實際上反映了微生物區(qū)系的改變。本試驗中,各蛋白分解菌在采食后3h均呈升高的趨勢,可能是因為動物采食2~3h后,蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)發(fā)酵降解為微生物的生長提供了充足的養(yǎng)分。采食后1h時,菜粕組各蛋白分解菌的數(shù)量均高于豆粕組,9h時正好相反,這主要是因為菜粕的快速降解部分高于豆粕和棉粕,豆粕慢速降解部分高于菜粕。豆粕組嗜淀粉瘤胃桿菌的數(shù)量最高,溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量最低,可能因為豆粕的粗蛋白、可溶性蛋白及可發(fā)酵碳水化合物含量相對較高,