三種大鼠動脈粥樣硬化模型建立方法的比較

建立合適的動脈樣本硬化（as）動物模型是研究疾病機制和采取治療措施的重要先決條件。As是多因素引起的慢性炎癥性反應,涉及脂質浸潤、鈣超載、內皮損傷等致病因素,為此,本文設計了三種大鼠動脈粥樣硬化模型建立的方法并進行了比較,為研究As的病因、發病機制和防治措施提供合適的動物模型。1材料和方法1.1實驗動物健康純種Wistar雄性大白鼠,體重200g(3～4月齡),由第二軍醫大學實驗動物中心提供。1.2實驗動物的造模處理40只大鼠隨機分為4組,每組10只:正常對照組喂基礎飼料。單純高脂組以高脂飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基礎飼料)喂養。高脂維生素組在喂高脂飼料的基礎上加維生素D3粉劑(1.25×106u/kg飼料)喂養,實驗開始時于右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105u/kg體重),每隔30天重復一次。內皮損傷組在給予高脂維生素組相同處理的基礎上,于第7天行大鼠主動脈內膜球囊損傷術。動物飼養在帶不銹鋼蓋底的塑料籠內,每籠2只,自由飲水,室溫19～23℃,自然采光。1.3球囊提取遠心端動物用戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)腹腔麻醉,背位固定,無菌條件下作頸正中切口,分離左頸總動脈,結扎遠心端,向心臟方向插入1.5F球囊,進入8cm后,注入0.2mL生理鹽水充盈球囊,手感到一定阻力向回拉約4～5cm,放水后再進入8cm,注水充盈、回拉、放水,反復3次,拔出球囊,結扎近心端。1.4動脈血樣的采集實驗第90天,各組動物禁食過夜,在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下,分離腹主動脈,在腎動脈分叉處下方,剪開腹主動脈,插入穿刺針,以注射器采集動脈血,用3000r/min立即離心15min,分離血漿,取1mL用檢測血脂和血鈣;剪下主動脈,取胸主動脈下段約1cm立即用10%甲醛固定,用于常規形態學和免疫組織化學檢查。1.5總膽固醇、triglycarli一概率用AbbottAerosetTM生物化學分析儀(美國亞培公司)檢測血漿總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDLC)、LDLC和Ca2+。1.6病理觀察1.6.1葉片組織病理學觀察將用10%甲醛固定的胸主動脈石蠟包埋,連續切片,切片固定于載玻片上,HE染色,光鏡觀察,利用HPLAS-1000型圖象分析系統檢測內膜、中層厚度。1.6.2平滑肌動蛋白單克隆抗體和enviity的鑒定采用微波EnVision法,應用小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體和α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體為一抗鑒定巨噬細胞和平滑肌細胞,EnVision復合物為二抗,常規DAB-H2O2顯色,蘇木素復染。1.7統計分析數據用ˉx±s表示,利用SPSS10.0統計軟件行方差分析,各組間兩兩比較用SNK法。2結果2.1結果分析工具實驗過程中共有4只大鼠死亡,其中單純高脂組死亡1只,高脂維生素組死亡2只,內皮損傷組死亡1只,對照組無死亡。實際用于結果分析的共36只。實驗發現,正常對照組大鼠的體重隨飼養的時間延長而逐漸增加,但單純高脂組、高脂維生素組和內皮損傷組大鼠的體重在最初一個月增長,到第二個月基本不變,在第三個月略有減少,但組間差異無統計學意義(表1,Table1)。2.2對三組大鼠血清tc、tg、ldlc的影響血脂和血鈣變化見表2(Table2)。經方差分析,與正常對照組相比,其它三組動物血清TC、TG和LDLC均明顯升高(P<0.01),HDLC各組間差異無統計學意義。與正常對照組和高脂組相比,高脂維生素組和內皮損傷組動物血清Ca2+均明顯升高(P<0.01)。2.3組織病理學檢測各組動物胸主動脈經HE染色在顯微鏡觀察發現,正常對照組管腔圓形,內膜、中膜和外膜分界清楚,管腔面由單層內皮細胞覆蓋,細胞完整,中膜主要見梭形平滑肌細胞;外膜較薄,為疏松結締組織。高脂組管壁層次尚清晰,內膜內皮細胞完整,中膜無明顯萎縮、增厚,外膜為疏松結締組織。高脂維生素組管壁明顯增厚,平滑肌增生明顯,細胞排列紊亂,纖維組織增生伴片狀或點狀鈣化,彈性纖維層結構不清,形成纖維增生性動脈粥樣硬化斑塊。內皮損傷組管壁內皮細胞脫落,內膜增厚,斑塊表面纖維帽薄,突出的斑塊內含有壞死物質,平滑肌細胞減少,纖維組織增生伴片狀或點狀鈣化,中膜明顯萎縮,呈較典型的成熟動脈粥樣硬化斑塊(圖1,Figure1)。2.4動物說中膜厚度用圖像分析儀檢測的胸主動脈壁內膜和中膜的厚度見表3(Table3)。與正常對照組相比,高脂組動物內膜和中膜厚度均無差別;高脂維生素組內膜增厚(P<0.01),中膜萎縮(P<0.05);內皮損傷組內膜明顯增厚(P<0.001),中膜明顯變薄(P<0.01)。2.5下d型用特異性巨噬細胞抗體CD68抗體為一抗,陽性為橢圓形黃染。可見正常對照組陰性、高脂組和高脂維生素組為弱陽性,內皮損傷組為強陽性(圖2,Figure2)。2.6梭形黃染染用特異性平滑肌抗體α平滑肌肌動蛋白抗體為一抗,陽性為梭形黃染。可見正常對照組、高脂組基本正常,高脂維生素組內膜有較厚的α-actin陽性,內皮損傷組斑塊表面只有很薄的α-actin陽性(圖3,Figure3)。3大鼠as動物模型的篩選建立合適的動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)動物模型是研究其發病機制及探討治療措施的重要條件。在常用的實驗動物中,草食性動物家兔不易自發性產生As,但它對高脂飲食特別敏感,故有人將它作為As模型,但它產生的損害更類似黃瘤病,而不象人的As。谷食性動物雞可產生自發性As,但主要形成脂質條紋,且它的局部解剖學與人不同,也限制了它的應用;猴和豬的系統發育和飲食結構類似于人,可產生自發性As,是研究As的理想實驗動物,但由于購買和維持費用的昂貴,難以作為模型使用;鼠類雖具有抗As特性,但由于應用的廣泛性、易獲得、易飼養;屬雜食類動物,生理解剖與人類相似;重要的是可用于實驗研究的商用抗體種類豐富;所以人們還是不斷摸索建立鼠類As模型。由于大鼠無膽囊,單純用含膽固醇的飼料不易使大鼠血清膽固醇增高,故不易形成As病變。因此本實驗的高脂飼料配方中,增加了膽酸鈉和丙基硫氧嘧啶,前者能顯著增加膽固醇吸收量,后者使甲狀腺功能低下,最終使TC和LDLC增高,HDLC降低。單純高脂飼料組只發現可形成高脂血癥,卻并沒有形成As病變,可能與大鼠本身內在的抗As因素有關。據報道不同種的動物主動脈膽固醇酯酶活性不同,大鼠>豚鼠>狗>兔>豬,這個順序顯然與抗As的種屬特異性頗為一致。維生素D誘發動脈壁的損傷和粥樣硬化形成已有報道,高脂+鈣超載組在胸主動脈形成了具有平滑肌細胞增殖以及泡沫細胞形成的增生性纖維斑塊,但還不是成熟的動脈粥樣硬化斑塊,這也限制了該模型的廣泛應用。維生素D誘發As的機理目前仍存有爭論,有作者認為,維生素D誘發動脈粥樣硬化是由于它能使血漿膽固醇升高之故;也有作者認為,與維生素D導致的血鈣升高有關。在本實驗中,單純高脂組、高脂維生素組和內皮損傷組,血脂水平無差別,似乎說明維生素D誘發動脈粥樣硬化與血漿膽固醇升高無關;我們認為可能的機理是:①維生素D導致血鈣升高,破壞動脈管壁內皮的完整性,有利于血漿脂質對管壁侵入和損傷,從而形成動脈粥樣硬化;②維生素D導致血鈣升高,可促使鈣鹽在主動脈中膜沉積,使平滑肌細胞變性或鈣化。Kramsch等發現在As形成過程中,平滑肌細胞的遷移和增殖,以及分泌細胞外基質都需要鈣離子作為第二信使,Weinstein等發現在As動物模型中,鈣離子拮抗劑可抑制As病變的進展,也都從側面說明了鈣離子在As形成過程中的重要性。內皮損傷組胸主動脈HE染色見典型的且較成熟的動脈粥樣硬化斑塊:病變處內皮細胞脫落,內膜明顯增厚、纖維化,血管壁向管腔內突出,斑塊內含有大量的泡沫細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞,纖維組織增生伴片狀鈣化,中層平滑肌細胞明顯萎縮;巨噬細胞免疫組織化學、α平滑肌肌動蛋白免疫組織化學結果也說明了該模型的成功。該模型的成功建立說明了在較短時間內建立較成熟的動脈粥樣硬化斑塊模型,內膜的機械損傷十分必要,因為它直接造成內膜的損傷、剝脫,內彈力板的斷裂,極大地加速了脂質及鈣鹽的沉積、血流中炎癥細胞的侵入;而單純高脂或/和鈣超載只能通過較長時間的應用,使機體內環境的發生改變,進而造成易損血管的生理生