酶促大豆多肽制備工藝的研究

它也被稱為芥末、黃瓜、霉菌豆腐、長(zhǎng)毛豆腐和乳腐。它是中國(guó)的豆制酸生產(chǎn)產(chǎn)品。發(fā)酵成熟的腐乳具有營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)構(gòu)細(xì)膩柔滑、滋味鮮美和誘人食欲的特點(diǎn),是人們喜愛的開胃佐餐食品和調(diào)味品,在眾多的豆制品中占有十分重要的位置。腐乳后酵過程,微生物所分泌的酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解,使其轉(zhuǎn)化成更有利于吸收的氨基酸和多肽類,多肽的含量豐富、營(yíng)養(yǎng)平衡,是大豆蛋白的最佳營(yíng)養(yǎng)保健狀態(tài),且具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的作用。傳統(tǒng)腐乳后酵是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過程,后酵期一般為2至6個(gè)月,甚至更長(zhǎng),半成品占用空間大,給擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模帶來困難。本文目的在于研究促熟腐乳工藝的可行性,以豆?jié){為原料,采用酶解法生成大豆多肽制成酶促熟腐乳,通過單因素和正交實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)地分析制備酶促腐乳的最佳酶解條件,為生產(chǎn)酶促腐乳提供了一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1elegns菌株大豆,天津市利民調(diào)料有限公司,并保存于實(shí)驗(yàn)室常溫干燥環(huán)境;MT-53X菌粉(乳酸菌種、乳脂鏈球菌種和嗜熱鏈球菌種)、酶制劑Ⅰ、酶制劑Ⅱ,帝斯曼(中國(guó))有限公司;雅致放射毛霉Actinomucorelegans菌株(文中簡(jiǎn)稱毛霉),本實(shí)驗(yàn)室保藏;Gly-GlyTyr-Arg,Sigma公司;三氯乙酸(TCA),天津市大茂化學(xué)試劑廠,CuSO4·5H2O、NaOH均為分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。FW-100型高速萬能粉碎機(jī),北京中興偉業(yè)儀器有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;DK-S12型電子恒溫水浴鍋,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LXJ-Ⅱ型低速離心機(jī),上海醫(yī)用分析儀器廠;LGJ-50F型凍干機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱,天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;自制腐乳壓榨模具。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1glygly-tyr-arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用5%的TCA水溶液依次配制0mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的GlyGly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中,然后分別取6.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入4.0mL雙縮脲試劑,混合均勻,靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液于540nm下測(cè)定吸光度(以第1管做空白對(duì)照)。以大豆多肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2大豆多肽提取液的制備將腐乳去皮,凍干,粉碎,精確稱取1.00g腐乳粉末于比色管中,按要求加入9mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TCA,55℃浸提30min,取出待其冷卻后,3000r/min離心5min,得到大豆多肽提取液。1.2.3離心條件下離心取2.5mL提取液,加入2.5mL10%的TCA水溶液,于漩渦混合儀上混合均勻,靜置10min,然后在4000r/min下離心15min,將上清液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中,并用5%的TCA水溶液定容至刻度,搖勻。取6.0mL上述溶液置另一試管中,加入雙縮脲試劑4.0mL,于漩渦混合儀上混合均勻,靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液于540nm下測(cè)定吸光度,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的大豆多肽質(zhì)量濃度,進(jìn)而可求得樣品中大豆多肽含量。1.2.4大豆多肽的測(cè)定單因素試驗(yàn)研究了酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ在不同底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量及酶比例對(duì)大豆多肽含量的影響。按以上5個(gè)因素的不同設(shè)定條件測(cè)定大豆多肽的含量。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以大豆多肽含量為考察指標(biāo),確定兩種酶水解腐乳的最佳條件。1.2.5酶促進(jìn)腐敗生產(chǎn)大豆→浸泡→磨漿、煮漿→冷卻→添加乳酸菌→添加酶制劑→凝乳→劃塊、排水→壓榨成形→接種毛霉→毛坯→密閉水解→滅酶→后酵→酶促腐乳2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以大豆多肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),大豆多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。2.2單酶酶解的工藝2.2.1結(jié)果圖1在酶解溫度為50℃,酶解時(shí)間4h,加酶量0.01%下,研究底物濃度(固形物含量)為4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%時(shí)大豆多肽含量,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,底物濃度較低時(shí),二種酶均為隨著底物濃度的升高,大豆多肽含量上升,且都在6.0%的時(shí)候達(dá)到最大值,底物濃度繼續(xù)升高,則大豆多肽含量下降。這主要是因?yàn)樵诘蜐舛鹊臅r(shí)候,溶質(zhì)的流動(dòng)性好,酶與底物的結(jié)合充分,水解度逐漸上升,大豆多肽含量升高;隨著底物濃度的升高,溶質(zhì)的流動(dòng)性變差,酶與底物的結(jié)合不充分,底物與酶結(jié)合量減少,限制了反應(yīng)的進(jìn)行,從而引起水解度的降低,大豆多肽含量下降。因此選擇底物濃度為6.0%作為最佳底物濃度。2.2.2大豆多肽的含量在底物濃度(固形物含量)為6.0%,酶濃度為0.01%,酶解時(shí)間為解4h,分別控制溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃,結(jié)果見圖3。由圖3得出,40-50℃,大豆多肽含量呈上升趨勢(shì);當(dāng)溫度高于50℃時(shí),大豆多肽含量呈下降趨勢(shì)。這是由于適當(dāng)?shù)募訜峥墒姑富钚赃_(dá)到最佳狀態(tài),同時(shí)也使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松,暴露出更多的酶作用位點(diǎn),但當(dāng)溫度過高時(shí),酶蛋白部分變性,反應(yīng)速度下降,因此,50℃為該體系的最適水解溫度。2.2.3大豆多肽含量在底物濃度(固形物含量)為6.0%,酶解溫度為50℃,加酶量0.01%時(shí),研究酶解時(shí)間2h,3h,4h,5h,6h時(shí)的大豆多肽含量,結(jié)果如圖4所示。由圖4分析得,酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ都隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),大豆多肽含量呈上升趨勢(shì),在4h以后變化趨于平緩,水解4h與水解6h大豆多肽含量相差不大。這是由于在水解初期,底物濃度較高,對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用小,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物的反饋抑制作用逐漸增強(qiáng),酶促反應(yīng)速度逐漸降低,最終達(dá)到平衡。因此綜合考慮成本問題,4h為最佳酶解時(shí)間。2.2.4酶用量對(duì)大豆多肽含量的影響在底物濃度(固形物含量)為6.0%,酶解溫度為50℃,酶解時(shí)間為4h,分別添加酶制劑量為0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%時(shí)的大豆多肽含量,結(jié)果見圖5。由圖5得出,大豆多肽含量隨著酶用量的增加有略微的降低,可能因?yàn)楫?dāng)酶制劑濃度過了峰值,酶促反應(yīng)受底物濃度的反饋抑制,導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。因此,酶濃度為選取0.01%作為該體系的最適添加量。2.3復(fù)合酶制劑對(duì)水解乳的影響由于每一種酶具有專一的特異性酶切位點(diǎn),當(dāng)這類位點(diǎn)全部斷裂以后,即時(shí)酶沒有完全失活,或者繼續(xù)加入酶,水解度都難以提高。因此,為了進(jìn)一步提高腐乳的水解度,可以利用不同酶制劑的特異性催化位點(diǎn)的不同,采用復(fù)合酶制劑水解的方法,增加酶制劑的特異性催化位點(diǎn),提高水解度,從而達(dá)到提高大豆多肽含量的目的。為了節(jié)約成本,結(jié)合酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ單因素的最佳酶解條件,實(shí)驗(yàn)中保持酶總量0.01%不變,在底物濃度為6.0%,水解溫度為50℃,酶解時(shí)間4h,以酶制劑Ⅰ∶Ⅱ?yàn)?∶1、8∶2、71∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9配制復(fù)合酶制劑加入到豆?jié){中,研究大豆多肽含量的變化,結(jié)果如圖6。從圖6得出,使用復(fù)合酶制劑水解腐乳時(shí),水解度有明顯提高,高于單一酶制劑水解腐乳的水解度。其中當(dāng)復(fù)合酶制劑比例為3∶7時(shí),水解度明顯高于其他組。因此選擇最佳配比。2.4酶解最佳條件的確定為獲得復(fù)合酶制劑水解最佳工藝參數(shù),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定酶制劑總濃度為0.01%,酶制劑I∶II比例為3∶7,以底物濃度、酶解時(shí)間、水解溫度3個(gè)因素為自變量,以大豆多肽含量為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)來確定酶解的最佳條件。其實(shí)驗(yàn)因素水平選取見表1,實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2,方差分析見表3。從表2根據(jù)極差R的大小得出:3個(gè)因素對(duì)大豆多肽影響大順序依次為C>B>A,即酶解時(shí)間>酶解溫度>底物濃度,由表3看出,底物濃度,酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)大豆多肽含量的影響均顯著。理論最佳工藝條件為A2B2C3,即底物濃度6.0%,酶解溫度50℃,水解時(shí)間為