海灣扇貝自交系和雜交系的建立

混合是水生生物育種的重要手段之一，在水生生物的品種改良和生產中發揮著重要作用。由于雜種優勢(heterosis)或雜種活力(hybridvigor)的存在,雜交能迅速和顯著地提高雜種的產量或生活力。因此,利用雜種優勢使貝類的生長、存活等表型性狀獲得改良的研究,國內外都有報道。國外的研究主要集中在牡蠣上,Sheridan已對此做了詳細地評述,此外,其他種類如,扇貝、硬殼蛤等也有少量報道;國內在牡蠣、鮑和扇貝等種類做過一些初步研究。海灣扇貝(ArgopectenirradiansirradiansLamarck)自1982年從美國引進到中國后,形成了新的養殖產業。然而,近十余年來,海灣扇貝在育苗與養殖過程中,病害頻發、個體小型化。產生這些問題的原因與海區環境惡化、養殖結構不合理、病原生物增加等有關,也與其種質質量有關。盡管通過改進養殖技術和反復引種都能夠使上述問題得到一定程度的解決,但都非長遠之計,只有借助于遺傳育種技術提高其抗逆性、培育新品種,才能使這些問題從根本上得到解決。海灣扇貝是一種優良養殖貝類,為雌雄同體,既可自體受精也可異體受精。通過不同的交配策略既可建立自交系又可建立雜交系,因而是遺傳學、育種學和分子生物學等研究的好材料。我們利用國內現有的海灣扇貝兩個相對獨立的不同養殖群體作為材料,采用配對雜交的交配策略建立了不同的雜交系,同時利用自體受精的方法建立自交系作為雜交系的對照,以研究雌雄同體型貝類雜交的生物學效應,如生長和存活等方面的雜種優勢,為其種質改良,培育新品種提供理論依據。本文報道了海灣扇貝雜交實驗的初步結果。1材料和方法1.1不同的養殖群體實驗用的海灣扇貝(ArgopectenirradiansirradiansLamarck)種貝來自于兩個不同的養殖群體。A群體是1982年從美國引進、在中國已繁殖了近二十代的后代,B群體是1999年初河北農業大學水產學院從美國麻省和佛吉尼亞兩地分別引進的原種在中國已繁殖了3代的混交后代。種貝均來自萊州市盛大海洋貝類選育中心,2002年2月下旬種貝在紅超水產集團的扇貝育苗車間進行性腺促熟,整個促熟過程遵循嚴格的生產技術流程1。1.2引幼制和培養繁殖方法使用A、B兩個群體的各4個種貝進行了自交和配對雜交實驗。A群體種貝自體受精(A♀×A♂,AA),B群體種貝自體受精(B♀×B♂,BB),A群體種貝的卵與B群體種貝的精子受精(A♀×B♂,AB),B群體種貝的卵與A群體種貝的精子受精(B♀×A♂,BA)。自交組為雜交組的對照。扇貝的性腺從外觀上看已發育成熟至第IV期時,采用升溫刺激法對每個個體分別進行催產,精、卵分開收集。每個扇貝產的卵均分為兩部分,一部分卵用做自交,另一部分卵用做雜交。自交系的建立參照鄭懷平等的方法。建立雜交系的方法是:洗卵(洗去可能存在的精子)——卵放在30μm孔徑的篩網中用23℃的海水反復沖洗;鏡檢——發現無精子的卵才可以加入配對種貝的精液進行授精,同時,取少量的卵子不加入精液作為對照組,并連續觀察1~2h后,如發現該對照組有受精胚體,則其對應的實驗組材料全部放棄。自交組和雜交組的卵在受精5min后,都用23℃海水洗卵,防止過多精子影響胚胎孵化。各組受精卵孵化密度相同(每毫升約25個受精卵)。所有實驗組的幼蟲培育、稚貝保苗和養成都是在同樣的環境條件下進行,并嚴格按照海灣扇貝苗種生產和養殖技術的工藝流程進行。幼蟲培育和稚貝保苗等是在青島紅超水產集團的扇貝育苗車間和室外保苗池中進行;養成在山東萊州盛大海洋貝類選育中心的金城扇貝養殖場進行。1.3密度因素對生長的影響幼蟲階段,每2天隨機取樣30個,進行大小測量,利用回歸方程求出幼蟲的日生長速度;每3天測量幼蟲存活率,之后將各實驗組的幼蟲培養密度再調置于同一水平,以盡量減小密度因素對實驗結果的影響。稚貝期和養成期,每30天用游標卡尺測量大小(精度為0.02mm),利用回歸方程求出扇貝的日生長速度;記錄各層扇貝的存活數,并對各籠層的扇貝做調整,使每層的扇貝個數相等,以消除密度效應的影響。1.4生長、生長、現存表型參照Cruz和Ibarra使用的方法,用下面的3個公式來計算雜種優勢(Heterosis):式中,AA、BB、AB、BA分別表示4個實驗組的F1在同一日齡時的表型值(生長、存活);公式(1)、(2)、(3)分別用來計算A、B兩個群體總的雜種優勢以及A群體和B群體各自的雜種優勢。1.5a、b兩群體優勢種群的t檢驗不同實驗組間數據的比較采用單因素方差分析方法進行,A、B兩群體各自的雜種優勢進行了t檢驗,方差分析用SPSS10.0統計分析軟件,差異的顯著性都設置為P<0.05。2結果2.1形態特征的比較AA、BB、AB和BA4個實驗組幼蟲在1、3、5、7和9d的平均殼長、生長速度以及雜種優勢列于表1。一日齡幼蟲的平均殼長在AA、BB、AB和BA各組間沒有顯著性差異(P>0.05),雜交組并沒有表現出生長優勢,其值為零。雜種優勢從三日齡幼蟲開始出現,而且隨著幼蟲日齡的增長雜種優勢逐漸增大(表1)。從第5天起,兩個雜交組AB和BA的平均殼長均顯著地大于與之對應的兩個自交組AA和BB的(P<0.05)(表1)。兩個自交組AA和BB的同一日齡幼蟲,前者總比后者小(表1),且5日齡時有顯著性差異(P<0.05);與自交組相似,兩個雜交組AB和BA的同一日齡幼蟲,前者也總比后者小(表1),同樣在5日齡時有顯著性差異(P<0.05)。幼蟲生長速度(μm·d-1)從大到小依次為BA、AB、BB、AA,其值分別為10.675、9.773、7.880、7.230(表1),BA組顯著大于其他三組(P<0.05),其他3組間無顯著性差異(P>0.05)。生長速度的雜種優勢為35.53%~35.13%,BA組略大于AB組(表1)。雜交組AB和BA的存活率都比與之對應的自交組AA和BB高(表2),顯示雜種優勢的存在,但不具有顯著性差異(P>0.05)。AB組的雜種優勢大于BA組,其平均值分別為28.75%和12.36%。2.2生長速度mmd-1AA、BB、AB和BA4個實驗組在70、100、130和160日齡時的平均殼長、生長速度和雜種優勢率列于表3。無論在何日齡,自交組AA的平均殼長始終都顯著地小于其他3組(P<0.05),而雜交組BA一直都是最大(表3)。雜交組BA的平均殼長僅在160日齡時才顯著地大于與之對應的自交組BB(P<0.05),在其他3個日齡時差異不顯著(P>0.05),但對于雜交組AB,無論在哪個日齡,其值都顯著地大于與之對應的自交組AA(P<0.05)。生長速度(mm·d-1)從大到小依次為BA、AB、BB、AA,其值分別為0.437、0.397、0.389、0.277(表3),只有BA組顯著地大于AA組(P<0.05),其他三組間無顯著性差異(P>0.05)。盡管兩個雜交組AB和BA的生長速度都比對應的兩個自交組AA和BB的大(表3),但差異并不顯著(P>0.05)。生長速度的雜種優勢為25.23%,AB組的43.32%遠大于BA組的12.34%(表3);就A、B兩個群體相比,A群體獲得的雜種優勢始終比B群體獲得的大(表3),且有顯著性差異(P<0.05)。從表4可以發現,在從7月初到9月底的三個月海上養殖過程中,盡管兩個雜交組AB和BA的存活率始終都比與之對應的自交組AA和BB的高,但卻沒有顯著性差異存在(P>0.05),僅BA組的存活率在8月份顯著地大于AA組的(P<0.05)。存活的雜種優勢也是明顯存在的(表4),平均值為31.46%,但A群體的雜種優勢和B群體的比,二者無顯著性差異存在(P>0.05),其平均值分別為49.44%和21.29%。3討論3.1群體遺傳多樣性雜種優勢是一種復雜的生物學現象,親本間的遺傳差異無疑是重要的原因之一,如果兩個基礎群體的基因頻率不同,那么它們之間的雜交有可能表現出雜種優勢。當一個種的不同群體能夠用來進行人工雜交時,必須評估兩個群體間是否有足夠的差異。因此,在討論本實驗獲得的雜種優勢之前,首先要評估實驗中所使用的兩個親貝群體間是否存在遺傳差異。海灣扇貝自1982年成功地引進中國后,在1992年和1999年又進行了兩次引種,三次引種形成了三個不同的養殖群體。就我們實驗所用的兩個群體而言,A群體是1982年引種的后代,由于最初引進的種貝只有26個存活、連續多代的人工近親繁殖(約20代)和苗種生產者對種貝的不恰當選留等,群體最初的遺傳多樣性已絕大部分丟失,因而群體的存活率下降、生長速度減緩、商品貝體型變小、肉柱得率越來越低;B群體是1999年引種的后代,由于引種數量較多(406個,個人通信)、繁殖代數少(3代),遺傳方差大、殼色多態性高(個人調查),仍具有較高的遺傳多樣性,因而,群體有良好的表型性狀,如生長快、抗逆性強、肉柱得率高等(個人調查)。可以初步推斷A、B兩個群體間存在著較大的遺傳差異。我們的實驗是在同一條件下進行的,環境對兩群體表型性狀的影響可以排除,因此,兩群體的表型差異主要來自于遺傳差異。從我們的結果來看,無論是在幼蟲期還是在養成階段,兩個表型性狀——生長和存活,A群體自交組都小于B群體自交組,且在養成階段A群體自交組顯著地小于B群體自交組(表1~表4),這也進一步證實了前文的推斷。3.2與a、b群體的雜交后的生長和生長特性從實驗分析結果看,雜交使種群的生長和存活得到改良。就生長性狀而言,無論是在幼蟲期還是在養成階段,雜交組都比自交組生長快,雜種優勢非常明顯(表1,表3),幼蟲階段達35%以上,養成階段也大于20%。自交組AA的幼蟲生長速度只有7.230μm·d-1,但通過與B群體雜交,其雜交組AB的生長速度被提高了35.17%;自交組BB的幼蟲生長速度也只有7.880μm·d-1,通過與A群體的雜交,其雜交組生長速度也提高了35.47%。在養成階段,自交組AA的生長速度只有0.277mm·d-1,但通過與B群體雜交,其雜交組BA的生長速度提高了43.32%;通過與A群體的雜交,雜交組BA的生長速度也提高了12.34%,只是沒有AB提高得多。就存活性狀而言,兩個雜交組在幼蟲期和養成階段的存活率都高于相應的自交組(表2,表4),雜種優勢的平均值在幼蟲期為19.93%,在養成階段為31.46%。通過與B群體的雜交,A群體獲得了25.23%(幼蟲期)和49.44%(養成階段)雜的種優勢;通過與A群體的雜交,B群體也獲得了12.36%(幼蟲期)和21.29%(養成階段)的雜種優勢,但比A群體的小。由于A、B兩個群體間存在著較大的遺傳差異,這些結果與Falconer等提出的“如果兩個基礎群體的基因頻率不同,那么它們之間的雜交將表現出雜種優勢”、“不同的群體配對表現出不同的雜種優勢大小”等觀點不謀而合。其他貝類不同遺傳群體或系群間雜交的一些研究也能夠給我們的結果提供佐證。實驗還發現,雜交使A群體獲得的改良效果比B群體的好(養成階段尤為明顯),這可能是由于A群體的雜合度得到更大的提高所致。許多研究表明,貝類群體雜合度與其生長和適合度有正相關。與B群體相比,A群體的雜合度低,雜交使其雜合度得到了更大的提高,因此,A群體獲得了更好的雜交效果。至于在幼蟲期,A群體的雜種優勢并不比B群體的明顯,這可能由于母性效應所