第二章蛋白質要點：蛋白質相對分子質量的測定方法及其原理氨基酸結構特點、分類、理化性質（解離、成肽）肽鍵及肽鍵平面一級結構測定、高級結構、結構與功能的關系蛋白質的性質（膠體、變性、沉淀、顏色反應）蛋白質分離純化常用方法及其原理§2-1蛋白質的生物功能、化學組成及其分類蛋白質的生物功能：塑造功能催化功能運輸和儲存功能協調運動功能機械支持功能免疫保護功能調節代謝功能生成、接受、傳遞信息功能蛋白質的元素組成主要成分：C52%、H7%、O23%、N16%、S2%。有些Pr還含有其他一些元素，主要是P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn等凱氏定氮法測定Pr含量的計算基礎：Pr含量=蛋白氮÷16%補充：凱氏定氮法只有蛋白質才能用需加入三氯乙酸，測定非蛋白氮含氮有機物+濃H2SO4△K2SO4或Na2SO4↑沸點，CuSO4催化M(滴定酸)=M(待測N)Pr含量=蛋白氮÷16%CO2

H2ONH3+濃H2SO4

濃堿+(NH4)2SO4NH3→→→硼酸蒸餾酸滴定恢復硼酸[H+]三聚氰胺，白色粉末無氣味，無味道含氮量66%是牛奶的151倍是奶粉的23倍使測試Pr含量增加一個百分點作假花費只有真實花費的1/5蛋白質的相對分子質量6000到1000000Da或更大根據化學組成測定最低相對分子質量凝膠過濾法測定相對分子質量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法沉降分析法AA殘基的數目×110≈Pr分子量垂直板電泳電泳速度v=Eq/f沉降系數（S）與蛋白質的密度和形狀相關對形狀高度不對稱的纖維狀蛋白質不適用蛋白質的分類分子形狀分類：球狀Pr和纖維狀Pr分子組成分類：簡單Pr和結合Pr簡單蛋白按溶解度分類：清Pr、球Pr、谷Pr、醇溶Pr、精Pr、組Pr和硬Pr結合蛋白按輔基分類：糖Pr、核Pr、脂Pr、磷Pr、金屬Pr、血紅素Pr、黃素Pr生物功能分類：酶、調節Pr、轉運Pr等蛋白質的水解水解方法反應物產物優點缺點酸水解硫酸或鹽酸L-氨基酸不消旋Trp被破壞；羥基AA被分解；酰胺基被水解堿水解NaOHD-，L-AA混合物Trp穩定多數AA被破壞；消旋；Arg脫氨生成鳥氨酸和尿素酶水解酶大小不等的肽段和AA不消旋；不破壞AA時間常；需多種酶參與作業：簡述凝膠過濾法測定蛋白質相對分子質量的原理簡述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質相對分子質量原理名詞解釋：道爾頓、沉降系數比較蛋白質三種水解方法的利弊§2-2氨基酸氨基酸的結構特點側鏈R基不同比旋光度是鑒別各種AA的重要依據有兩種立體異構，溫和酶解得到L-型，但在細菌中D-型AA也廣泛存在Thr和Ile在實驗室里可存在四種光學異構體，即D-、L、D-別-和L-別氨基酸的分類脂肪族氨基酸芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp雜環氨基酸：His、Pro非極性氨基酸：極性氨基酸：極性不帶電荷極性帶負電荷－酸性氨基酸極性帶正電荷－堿性氨基酸按側鏈R基的化學結構和性質分類中性非極性AA中性極性AA酸性AA堿性AA2.975.656.025.423.226.029.745.68pI10.765.025.977.595.985.755.486.306.535.895.665.97Ph=苯基Me=CH3人體必需氨基酸蛋白質的稀有氨基酸非蛋白質氨基酸均由相應AA殘基修飾而成，無遺傳密碼必需氨基酸蛋白質的互補作用如谷類中賴AA較少而色AA較多，大豆則相反。提倡食物多樣化，合理搭配“纈異亮蘇，賴蛋苯色”氨基酸的性質一般物理性質α-AA為無色晶體，熔點200℃以上每種AA都有特殊的結晶，可用來鑒別其味隨不同AA有所不同除胱AA和Tyr外，能溶于水，溶解度差別大，可溶于稀酸、稀堿一般不溶于有機溶劑。Pro和羥脯AA能溶于乙醇或乙醚AA的酸堿性質和等電點AA的兩性離子形式現象：熔點高，使水的介電常數增高，具有離子性質解釋：有機化合物—分子晶格—范德華力AA晶體—離子晶格—靜電吸引介電常數與電解質的極性結構有關，極性分子的介電常數高在20℃，水的介電常數為80，1M的α-AA水溶液為102~108同一個AA分子上帶有能放出質子的正離子（-NH3+）和能接受質子的負離子（-COO-）又稱兼性離子、偶極離子AA的解離解離度與溶液的pH有關注意酸堿的相對性AA的等電點凈電荷為零時，溶液的pH值（pI）靜電作用使pI時AA的溶解度最小pI計算：pI=（pK1+pK2）/2中性AA的pI都在6.0左右血紅Pr中含有較多的組AA，使得它在血液中具有明顯的緩沖能力把一個AA結晶加入到pH7.0的純水中，得到了pH6.0的溶液，問此AA的pI是大于6.0？小于6.0？還是等于6.0？從氨基酸解離角度解釋分析過程。AA的光學性質和光吸收AA的光學性質構型與旋光性的概念AA的光吸收可見光區沒有吸收紅外光區和遠紫外光區有吸收近紫外光區Tyr、Pro、Trp有吸收AA的化學性質α-氨基參加的反應：室溫下可與亞硝酸反應，用于AA定量和Pr水解程度的測定。賴AA的ε–NH2反應，但速度較慢R-CH-COOH+HNO2→R-CH-COOH+N2+H2ONH2OH生成Schiff’sbase（西佛堿）反應，與醛酮類化合物反應生成弱堿，是某些酶促反應的中間物（如轉氨基反應）。西佛堿-H2O+H2OC=O+H2N─Cα─COOHC=N─Cα─COOHR'R'RRHHHH甲醛滴定反應，與過量甲醛反應生成單或雙羥甲基氨基酸衍生物，促使-NH3+解離，堿性下降。通過測定游離-NH3+含量，可大體判斷Pr水解或合成的速度-OOC-CH-NH3+-OOC-CH-NH2+H+

OH-pK2′H+HCHO-OOC-CH-NHCH2OH-OOC-CH-N(CH2OH)2HCHON-羥甲基氨基酸N,N-二羥甲基氨基酸RRRR與酰化試劑反應，與酰氯或酸酐在弱堿溶液反應酰基化，中用作氨基保護試劑。丹磺酰氯（DNS）用于多肽鏈氨基末端AA的標記和微量AA的定量測定R1-C-X+H2N-CH-COO-

→R1-C-NH-CH-COO-R2R2OOOH-X=Cl，OCOR氨基酸酰化產物實例：苯甲酸是常用的一種食品防腐劑，可與甘氨酸反應轉變成N-苯甲酰甘氨酸，經尿排出烴基化反應，弱堿性條件Sanger反應：2,4-二硝基氟苯（DNFB）生成穩定的黃色2,4-二硝基苯AA（DNP-AA），用來鑒定Pr的N末端O2N--F+H2N-CH-COOHO2N--N-CH-COOH+HF弱堿中NO2NO2RRH（DNFB）（DNP-AA）（黃色）Edman降解反應：與異硫氰酸苯酯（PITC）生成PTC-AA，在無水酸中環化成穩定的PTH。可連續測出60個以上的AA順序脫氨基和轉氨基反應α-羧基參加的反應：成鹽和成酯反應，羧基被掩蔽，氨基被活化，更容易與酰基或烴基結合成酰氯反應，氨基被保護后，可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，使羧基活化，常用于多肽的人工合成中疊氮反應，氨基酰化保護后，羧基酯化成甲酯，與肼和亞硝酸反應生成疊氮化合物，活化羧基，應用于人工合成肽R─CH─COOHR─CH─COClPCl3，PCl5或SOCl2NHPGNHPG（PG－保護基）R-CH-COOCH3R-CH-CONHNH2R-CH-C-N-N≡NNH2NH2HNO2NHPGNHPGNHPGOCH3OHH2O，N2脫羧反應α-氨基和α-羧基共同參加的反應：與茚三酮反應，酸性溶液中共熱，α-AA脫氨脫羧，釋放NH3，水合茚三酮還原，與另一分子水合茚三酮在生成藍紫色物質(570nm)

脯AA和羥脯AA（亞AA）不釋放NH3，直接生成黃色物質(440nm)。成肽反應，一個AA的氨基與另一個AA的羧基縮合成肽，熱力學上不能自發進行，可通過活化羧基方法使反應順利進行HR1OH2N-C-C-OH+H-N-C-COOHH2N-C-C-N-C-COOH-H2OR1R2R2HHHHHO側鏈R基參加的反應：很多反應是Pr化學修飾的基礎Cys側鏈巰基（-SH）反應性能很高，易被氧化縮合成胱AA。可逆反應，穩定Pr構象上起很大作用，氧化劑（氧化成磺基氨基酸）和還原劑都可打開二硫鍵2-OOC-CH-CH2-SH-OOC-CH-CH2-S-S-CH2-CH-COO-氧化還原+NH3+NH3+NH3SO3H具有弱酸性；能與各種金屬離子形成穩定程度不同的絡合物羥基的性質形成氫鍵；與酸成酯蛋白質分子中，絲氨酸常與磷酸成酯絲氨酸是大多數蛋白水解酶活性中心的主要組分，多種酰基化劑能與酶活性中心的絲氨酸羥基作用導致酶失活咪唑基的性質生理條件下有緩沖作用咪唑環一側的去質子化與另一側的質子化同步進行，能夠發生多種化學反應，如磷酰化反應、烷基化反應等甲硫基的性質強親核中心，易與鹵代烷等發生親核取代反應形成烷基化產物H2NCH(CH2)SCH3+14CH3I→→H2NCH(CH2)2SCH3H2NCH(CH2)SCH3+H2NCH(CH2)2S14CH3COO-COO-COO-COO-14CH3弱堿巰基試劑芳香環的性質芳香環，共軛π電子體系紫外特征吸收峰，蛋白質的紫外吸收性質主要來自它們的貢獻可發生親電取代，如碘化、硝化和重氮化反應等顯色反應作業：推導氨基酸解離公式寫出苯甲酸鈉的防腐機理寫出丹磺酰氯與氨基酸的酰化反應過程§2-3肽肽及肽鍵兩個AA脫水縮合而成的化合物稱肽。AA之間脫水后形成的鍵稱肽鍵，又稱酰胺鍵，是AA在Pr分子中的主要連接方式由兩個AA縮合形成的稱二肽，十肽以下稱寡肽，十肽以上稱多肽HR1OHHHHHR2R1R2H2N-C-C-OH+H-N-C-COOHH2N-C-C-N-C-COOH-H2OON末端，習慣寫在肽鏈的左側，用H2N-或H-表示；C末端，習慣上寫在的右側，用-COOH或-OH表示命名原則：除C末端的殘基仍稱該AA的原名，并置于肽名末尾，其余均按酰基命名，并從N末端開始依次列出二硫鍵存在于肽鏈之間或之內注意：順序相反的肽鏈是一個不同的多肽肽鍵是Pr分子中AA連接基本方式的實驗根據Pr分子中游離α-氨基和α-羧基很少，水解過程中兩者以等摩爾數增加某些人工合成的多肽能被水解Pr的PrE水解，而且能催化它的逆轉，即在AA或多肽之間形成肽鍵包含酰基基團的化合物如雙縮脲能與CuSO4-NaOH溶液產生顏色反應，天然Pr也有同樣的反應人工合成的多聚AA的X射線衍射圖案和紅外吸收光譜與天然的纖維狀Pr十分相似我國在世界上首次人工合成Pr——結晶牛胰島素的成功，完全證明了Pr的肽鏈結構的正確性肽鍵的結構氮上的孤對電子與相鄰羰基之間的共振作用X射線衍射分析證實肽鍵長0.132nm，介于C-N（0.127nm）C=N（0.148nm）之間肽鍵平面：折疊成三維構象過程中非常重要肽鏈中肽鍵都是反式結構，以減少R基的空間位阻HHHR2R1H3N＋－C－C－N－C－COO－Oαα含脯AA的肽鍵順反式均可以，因為四氫吡咯環引起的空間位阻消去了反式構型的優勢多肽的性質多肽的兩性解離：解離情況復雜，主要取決于側鏈上的堿性和酸性基團的相對數目多肽鏈的反應可以發生AA的一切反應多肽鏈的水解酸水解、堿水解、酶水解補充：氨基酸的鄰基反應：如有Asn和Gly相鄰排列，側鏈酰氨基中的羰基碳原子具有弱親電性，正好與肽鏈主鏈上親核的氮原子距離5個原子，容易形成五元環，常引起氨基酸順序分析出現錯誤雙縮脲反應：含有兩個或以上肽鍵化合物可與堿性硫酸銅作用產生紫紅色或藍紫色絡合物，是多肽定量的重要反應OCOCH2NNH2H2NNH2OCOCH2NNNH2＋加熱NH3HHHR2R1H3N＋－C－C－N－C－C－N－C－COO－OααOHHR3α天然存在的活性寡肽主要作為化學信使，又稱為活性肽谷胱甘肽：某些酶的輔酶，在體內氧化還原過程中起重要作用。分子中存在特殊的γ-肽鍵，是由Glu的γ-羧基與Cys的α-氨基縮合而成。有還原型和氧化型CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COO-γCH2βCH2αCH2-NH3+COO-CH2SHγ-Glu-Cys-Gly

SSγ-Glu-Cys-Gly還原型－GSH氧化型－GSH腦肽：其中腦啡肽是高等動物腦中發現的比嗎啡更有鎮痛作用且不上癮的活性5肽。發現了C末端殘基分別為Met和Leu的兩種類型，其余四個AA是酪、甘、甘、苯丙AA。上海生化所82年5月利用Pr工程技術成功的合成了Leu-腦啡肽。β-內啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽Leu-腦啡肽Leu1975年有人從豬腦中分離出一種31肽的具有較強的嗎啡樣活性與鎮痛作用的β-內啡肽其第1～17位的降解片段稱為γ-內啡肽，無以上活性，但有抗精神分裂癥的療效+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser

-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-Ala-His-Lys-Lys-Gly-Gln-COO-催產素和升壓素：均為9肽。前者使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產及排乳作用，另有促進遺忘作用；后者促進血管平滑肌收縮，從而升高血壓，并有減少排尿作用，也稱抗利尿激素，還參與記憶過程NH2-Gly-Leu-Pro-Cys-Asn-Gln-Ile-Tyr-CysSS催產素升壓素ArgPhe胰高血糖素：29肽，可調節控制肝糖原降解產生葡萄糖，以維持血糖水平，還能引起血管舒張，抑制腸的蠕動和分泌。而胰島素功能正相反H2N-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COO-作業畫出肽鍵平面§2-4蛋白質的共價結構蛋白質的一級結構指Pr分子中AA的種類、連接方式和排列順序。各AA的不同側鏈對維持Pr分子的立體結構和行使Pr的功能起著重要作用除肽鍵外還有二硫鍵連接肽鏈內或肽鏈間的主要橋鍵穩定空間結構，與生物活力有關生物體內起保護作用的皮、角、毛、發的Pr中二硫鍵最多蛋白質一級結構的測定N-末端和C末端分析二硫橋的斷裂氨基酸組成的分析多肽鏈的部分水解各肽段的氨基酸序列的測定和完整肽鏈的氨基酸順序的確定二硫橋位置的確定N-末端：DNFB法、PITC法、DNS法、氨肽酶法C末端：肼解法、還原法（BHLi）、羧肽酶法H2O2+HCOOH氧化過量β-巰基乙醇還原（加碘乙酸保護-SH）酶裂解法化學裂解法Rn＝Pro則抑制水解或不水解溴化氰切割Met-肽鍵，專一性強，產率高羥胺切割Asn-Gly/Lue/Ala肽鍵胃蛋白酶水解-對角線電泳-含磺基丙氨酸肽段序列分析-確定二硫鍵位置補充：關于胰蛋白酶的水解位點Lys-、Arg-肽鍵-Pro肽鍵可抑制水解減少作用位點：馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護Lys側鏈上的ε-NH2，使酶只能斷裂Arg；用1,2-環己二酮修飾Arg胍基，則只能水解Lys增加作用位點：Cys殘基側鏈被氮丙啶修飾成類似Lys側鏈的ε-NH2，便可水解Cys-肽鍵例題：已知一七肽的組成為：Gly、Phe(2)、Tyr、Met、Asp、Arg。用胰凝乳蛋白酶水解后可得一個三肽和一個四肽，三肽組成為Phe、Tyr、Asp。此七肽經溴化氰處理后再經陽離子交換樹脂層析并洗脫得一個組成為Arg、Phe、Gly的三肽。此七肽經胰蛋白酶水解可得Phe，用FDNB反應后再水解測得DNP-Tyr，請確定該七肽的氨基酸順序，并寫出推導理由。蛋白質一級結構與功能的關系保守序列決定空間結構不同蛋白質之間的比較：相似結構相似功能、不同結構不同功能同一蛋白質不同狀態的比較：一級結構決定空間結構分子病和結構的關系保守序列、保守氨基酸改變，功能改變；保守氨基酸不變，功能不變前胰島素原胰島素原胰島素形成氫鍵的性能差異很大，引起空間結構顯著變化，水溶性明顯降低，血液粘性增大，產生貧血§2-5蛋白質的空間結構天然活性Pr都具有特征而穩定的三維結構；一旦遭到破壞，生物功能完全喪失是Pr區別于普通有機分子最顯著的特征可分為二級結構、三級結構和四級結構X射線衍射法，高分辨核磁共振技術一級結構基礎上形成，預測它的高級結構；一級結構改變也將影響到高級結構蛋白質的二級結構指主鏈的空間排列，只涉及主鏈的構象及鏈內或鏈間形成的氫鍵兩個相鄰的肽鍵通過一個共同的α－碳原子相連接，Cα－N和Cα－C鍵可自由旋轉，可保持肽鍵平面結構不變的條件下，形成不同的空間結構氫鍵維持主鏈空間排列主要有α－螺旋、β－折疊、β－轉角及無規則卷曲α－螺旋結構最常見，右手螺旋，相鄰螺圈之間形成鏈內氫鍵，氫鍵取向幾乎與螺旋中心軸平行AA殘基的R基團比較小，不帶電荷，則有利于形成和穩定；而脯AA則使其中斷β－折疊兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間氫鍵交聯而成側鏈垂直于折疊平面，交替分布于上下兩側幾乎所有的肽鍵都參與了鏈間氫鍵交聯，比較牢固有平行式和反平行式110°β－轉角非重復性結構，由四個氨基酸殘基組成，形成一個不很穩定的環狀結構主要存在于球狀蛋白中，并位于分子表面無規則卷曲無規律的松散肽鏈構象明確而穩定；有序的非重復性結構常出現于酶活性部位或蛋白質特異功能部位超二級結構和結構域超二級結構：若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規則、在空間上能辨認的二級結構組合體結構域：多肽鏈在二級結構或超二級結構基礎上形成三級結構的局部折疊區，是相對獨立、緊密、近似球狀的實體，各自具有部分生物功能的結構結構域之間有一段柔性肽鏈相連蛋白質的三級結構肽鏈在空間進一步盤繞折疊形成的包括主鏈和側鏈構象在內的特征三維結構，不涉及肽鏈間的相互作用多是球狀蛋白，形成親水外殼和致密疏水核維系三維結構的力主要有疏水鍵、離子鍵、氫鍵和范德華力等蛋白質的四級結構具有三級結構的多肽鏈通過非共價鍵締合在一起形成的大分子亞基單獨存在時常無活性，一般呈對稱性排列精細有序結構，通過分子中的各種價鍵來維持蛋白質分子與某種物質結合或受到其它理化因素影響，高級結構發生變化，其性質及生物功能也將隨之發生變化aabcccdef蛋白質的空間結構與功能的關系特定區域體現生物活性體現生物特異性變構現象體現生物活性的可調節特性并非生物活性的唯一影響因素蛋白構象疾病：如：低溫下酶活性低，但并不影響構象；鹽析時沉淀的酶無活性，但構象不變錯誤構象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病：如老年癡呆病、瘋牛病、亨汀頓舞蹈病§2-6蛋白質的性質具有多肽的一切性質蛋白質的兩性解離和等電點蛋白質的膠體性質蛋白質的變性與沉淀蛋白質的顏色反應分子大小屬于膠體質點范圍分子表面親水基團形成水化層，阻礙聚集分子表面解離基團電荷相斥，阻礙聚集實質：天然構象解體現象：活性喪失、基團暴露、理化及生化性質改變溫和變性的可逆反應——復性可逆沉淀：溫和條件下沉淀分離，如等電點沉

淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法等不可逆沉淀：強烈條件破壞結構和性質而沉淀。