第8章Prok基因表達的調控第一節相關概念及操縱元調控花式概述第二節乳糖操縱元（LacOperon）第三節TrpOperon及弱化作用機理第四節基因轉錄的時序調控第五節Prok.翻譯水平的調控第六節DNA序列重排對基因轉錄的調控第一節相關概念及

操縱元概述代謝調控過程是自身生存和繁衍所必須Prok.和Euk.都有各自準確調節基因表達的機制基因表達(geneexpression):基因表達調控(generegulationorgenecontrol):任何影響基因轉錄過程和翻譯過程的開啟、關閉和這兩個過程速率的較為直接的因素及其作用涉及：RNA轉錄的開/關，數量，選擇性加工蛋白質翻譯速率，數量，加工與降解和分泌…Prok.和Euk.的調控極其相似調控機制：核酸分子間的互作核酸與蛋白質分子間的互作蛋白分子間的互作調控層次：DNA水平的調控

轉錄水平上的調控

轉錄后水平的調控（mRNA加工成熟水平上的調控）翻譯水平上的調控翻譯后水平的調控共同的起源與共同的分子基礎●

轉錄水平上的調控是最為經濟,靈活，又是最為重要，復雜的調控a、在復雜的基因組內，確定需要基因轉錄的起始位點b、精細調節基因表達的水平,以保證生物體對環境的適應c、cisfactor&transfactor間嚴格而又靈活的互作d、保證RNApolymerase的進行式轉錄（不中斷，準確終止）●

生物遺傳信息的概念GenomeDNA10%;結構基因的編碼序列tripletcodon90%;重復，間隔，調節序列…基因選擇性表達指令重要的遺傳信息遺傳信息的兩大類別II類；特定DNAseq.+特定蛋白質/核酸結合基因表達的指令geneon/offI類；DNAseq.RNAseq.(codon)aaseq.protein表型(centraldogma)

內在信息內,外(信號分子)結合信息

ORFonlyHelix,Nt

seq….遺傳信息存在于模版鏈三維空間結構/DNA序列的一級結構上(IR,Box,paracodon…)三聯體密碼空間，調控密碼(鑰匙與鎖)簡并簡并搖擺同工受體cis1trans2cis2trans1cis1trans3cis3I類II類

表達specificalbindingaabaseDNARNAprotein●遺傳信息表達的方式（Euk.）組成型表達（constitutiveexpression）Housekeepinggene誘導型表達（inducibleexpressionbysignalingmolecular）Luxurygene順、反因子間互作方式的基因表達調控?順式作用元件（cis-actingelement）:對基因表達有調節活性的DNA序列，只影響與其同處一個DNA分子或物理上相連的DNA上的基因?反式作用因子（trans-actingfactor）:與順式作用元件相互作用影響基因表達的蛋白因子，其編碼基因與其識別或結合的靶核苷酸序列不一定在同一個DNA分子上●操縱元(Operon):Prok.中,基因表達調控的一個完整單元,包括結構基因和控制區(O、P)以及調節基因的整個核苷酸序列?操縱元中各結構基因按一定比例協調翻譯?具有極性突變效應：操縱元中一個近基因的無義突變能夠影響遠基因表達，且根據距離遠近呈極性梯度效應?P、O緊密連鎖或彼此重疊，I基因位點不固定（順式作用元件、反式作用因子）●正調控系統:沒有調節蛋白存在時，結構基因是關閉的，而加入有活性的調節蛋白后,結構基因的表達活性被開啟無輔基誘導物或激活物●負控制系統:沒有調節蛋白存在時，結構基因是開啟的，加入這種有活性的調節蛋白后，結構基因表達活性被關閉阻遏蛋白●所謂“關閉”指表達水平很低本底水平的基因表達(1～2個mRNA分子／細胞周期)“開啟”也常有程度的差異●操縱元的調控體系負調控系統正調控系統誘導阻遏●基因表達調控的分子機制1、調控蛋白質的對稱性與其識別序列的對稱性調控蛋白都是同種分子的多聚體－－二聚體、四聚體

二倍旋轉對稱通過單體和多聚體間的平衡迅速作用于特異識別位點之間提高調控作用的特異性（反向重復序列）inmajorgroove特異和非特異結合力2、調控蛋白的DNA結合結構域的主要花式主要有：α螺旋-轉角-α螺旋（HTH）Cys-Cys鋅指Cys-His鋅指調控蛋白上存在與DNA和其它蛋白質相互作用的位點

★α螺旋-轉角-α螺旋*兩個α螺旋被一個β轉角隔開*一個螺旋起識別結合DNA的作用3個—helix,H1與H2平行H2與H3形成HTHmotifH3位于大溝中，與DNA特異結合CⅠ蛋白N端有五個螺旋,螺旋2和3與DNA相互作用C端負責二聚體形成N端負責與DNA接觸★鋅指結構概念:與DNA結合的蛋白質中一小組保守AA與一個Zn2+結合起來形成蛋白質中一個相對獨立的結構域按結合的AA不同有兩種類型a、Cys-His(C2/H2)鋅指經典的鋅指蛋白中部芳香族氨基酸保守，加上Zn＋＋和Cys和His之間的配位結構形成疏水核經典的鋅指蛋白、類固醇受體（激素）不同鋅指蛋白中鋅指數目多少不等鋅指可以串聯重復排列，兩指間7-8aaTFⅢA有9個鋅指、通用轉錄因子SP1有三個經典鋅指的三維結構：一個β－折疊和一個α－螺旋鋅指上的α－螺旋負責與DNA作用b、Cys-Cys(C2/C2)鋅指類固醇受體Zn＋＋與4個Cys殘基形成配位鍵CysCys糖皮質激素受體ZYJ272

3、調控蛋白與蛋白質結合的方式（1）HLH結構特點：長40～50個AA殘基中含有兩個既親水有親酯的α螺旋,被不同長度的連接區隔開(環)此類蛋白借助兩個螺旋對應面上疏水基團的相互作用形成二聚體(同種或不同種亞基)鑒定的較清楚的蛋白質與蛋白質相互作用的結構基元有螺旋-環-螺旋（HLH）Leu拉鏈HLH基元附近有個高度堿性的區段為結合DAN所必須bHLH（2）Leu拉鏈蛋白上含有4或5個精確的相距7個AA的Leu殘基概念：調控蛋白上富含亮氨酸殘基的結構域參與形成二聚體Leu出現在α-螺旋疏水的一側，并直線排列于是，兩個蛋白分子的兩個α－螺旋之間依賴Leu殘基之間的疏水作用形成一條拉鏈Leu拉鏈區的氨基端約30個殘基的堿性區與DNA結合Leu拉鏈作用形成Y型結構，拉鏈為莖、堿性區分叉對稱成臂－－拉鏈蛋白的目標DNA為沒有間隔的反向重復第二節乳糖操縱元一、乳糖操縱元1961Jacob&Monod（法國）1、結構:2、調節基因I產物為阻遏蛋白,四聚體為活性形式轉錄方式為組成型轉錄LacI的表達效率很低,原因—其啟動子與RNApol的親和性很低阻遏蛋白有兩個結合位點:

操作子位點、

誘導物位點二、LacOperon的負調控1、細胞內無誘導物時,呈阻遏狀態阻遏蛋白和操作子的結合,影響了RNApol在-10序列上形成開放型的啟動子復合物2、細胞內有誘導物時,呈誘導狀態誘導物與阻遏蛋白迅速結合而改變其構象→→→從O上解離→→→RNApol3、誘導物?異乳糖(allolactose)乳糖進入細胞后，由β-半乳糖苷酶催化產生?β-半乳糖苷酶來源于乳糖操縱元的本底組成型合成RNApol利用LacO處于游離狀態的瞬間進行轉錄(阻遏蛋白與LacO有10min～20min的結合半衰期)一個mRNA／細胞周期?安慰誘導物（義務誘導物）可誘導半乳糖苷酶產生但不是其底物*IPTG，異丙基-β-D硫代半乳糖苷*TMG，巰甲基半乳糖苷*ONPG，O-硝基半乳糖苷4、阻遏蛋白與操作子的相互作用（硝酸纖維素膜結合試驗）

IPTGLacOCIR序列以+11為對稱軸兩邊為兩段各6bp的重復序列＋11+5到+17之間大部分在左側－5＋21操作子的結構LacRepressor=tetramer三、LacOpreon的正調控－－CAP-cAMP復合物cAMPCAP蛋白cAMPLowglucose=highcAMP總結lacoperontranscription-controlregion正控制：CAPprotein負控制：repressor第三節TrpOperon及弱化作用機理一、結構

?結構基因?末端---終止子trpt’(依賴ρ)、trpt(不依賴ρ)鄰氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶?相距很遠的trpR編碼阻遏蛋白其活性形式為四聚體,并且只有結合trp時才有活性?控制區域:P、O和前導區及弱化子?trpO與trpE之間的162bp的前導區可轉錄到mRNA中?trpO的結構*位于trpP內，20bp,有完美的IR序列*trpP有正常的－35和－10區，－10區完全在trpO內二、阻遏調控機制無trp時有trp時無活性※弱化作用控制-----基因轉錄的翻譯調控通過核糖體對前導區的翻譯而對轉錄進行調控弱化子（attenuator):TrpOperon中trpE前的一段非結構基因的對應序列（123－150），其中包括不依賴ρ因子的終止子，由于翻譯的作用使轉錄終止，這段序列稱為…(衰減子)發現－－－缺失增加結構基因的表達，且與阻遏蛋白無關弱化子調控的表現：（與阻遏蛋白的負調控結果類似）*無trp時，所有RNApol都能通過弱化子*有trp時，部分逃過阻遏蛋白監督的RNApol在弱化子處大部分被扣留，而只有10％能通過1、TrpOperonmRNA的前導序列結構?下游---14aa的前導肽的ORF，其中兩個相連的trp的codonUGG(60位)對弱化作用的實現起重要作用?下游長28bp的不依賴ρ因子的終止子為弱化子的核心部分?前面有核糖體結合位點（S－D序列）2、前導序列的二級結構決定RNApol在弱化子處是終止轉錄還是繼續轉錄1和2、3和4配對★序列1和2、3和4配對時，RNApol在3、4區的不依賴ρ因子的終止子處終止,其后的trpE等基因表達受到限制（翻譯作用不存在時或順利進行）2和3配對★序列2和3配對時，RNApol繼續轉錄，使前導序列后的結構基因得以轉錄3、弱化子弱化控制的機制

Prok.無核膜，轉錄和翻譯偶聯（1）細胞缺少trp，Trp-tRNATrp水平低，核糖體停頓在兩個鄰近的Trp密碼子處，此時核糖體占據序列1，此時序列4還沒轉錄出來，序列2和3有機會配對，RNApol可通過弱化子(3)此外,Arg饑餓時有相同的后果(2)當細胞有Trp時,Trp-tRNATrp水平很高,核糖體順利地翻譯出前導肽而在終止密碼子處(+70,UGA位于序列1和2之間)解離,此時,核糖體占據了序列1和部分序列2,使序列2不能有效地和序列3配對,因而序列3和4產生終止子發夾結構,轉錄終止?實現弱化子對轉錄的調控關鍵是時間和空間上的巧妙安排空間上：兩個Trp的codon位置至關重要時間上：核糖體停頓在兩個Trpcodon上時，序列4還沒轉錄出來，否則……這種巧妙安排的一個原因就是RNApol在轉錄完+90序列處時產生一次延宕給與核糖體以追趕的機會5、Prok.中弱化子（衰減子）的普遍性許多負責氨基酸合成的operon都受弱化子的控制，尤其是Hisoperon中，弱化子是唯一的調控機制第四節基因轉錄的時序調控時序調控:Prok.在生長發育的各個階段，基因的表達是按照一定的時間順序而展開的如:噬菌體的復制和顆粒的包裝*有效利用能源避免浪費*避免了某些基因表達時機不當所帶來的危害是多種蛋白質與RNApol作用的結果一、枯草桿菌中σ亞基的替換1、枯草桿菌中phageSPO1早、中、晚期基因表達的轉換早期基因---寄主的RNApol全酶σ55早期基因28編碼的gp28取代σ55含有gp28的全酶轉錄中期基因中期基因33、34編碼的gp33、gp34取代gp28以gp33－gp34為σ亞基的全酶轉錄晚期基因2、枯草桿菌孢子形成過程中σ亞基的替換二、λphage裂解性生長和溶源狀態的調控λphage進入寄主體內后環化其中—?裂解周期--環形分子大部分基因表達?溶源狀態--以線性分子形式整合到寄主的染色體上,使大部分基因不表達λPhage的操縱元組織情況(一)λphage裂解生長過程中的基因表達進入寄主cell的λphage的DNA上沒有任何調節蛋白，因此寄主的RNApol便結合于PL和PR1、抗終止蛋白PN和調節蛋白Cro首先被轉錄2、PN蛋白的作用導致PL和PR控制的遲早期基因的表達表達產物CⅢ蛋白、CⅡ蛋白、O蛋白、P蛋白、Q蛋白3、PQ蛋白的作用導致PR’控制的晚期基因的表達表達產物頭尾蛋白、溶菌酶蛋白（二）溶源途徑巧妙的調控，小區段表達，整合到寄主染色體上*此外，CⅡ促進Pint啟動子轉錄，使intgene表達產生整合酶1、溶源化的建立－－PE啟動子的轉錄*CⅢ、CⅡ蛋白共同確立PE處CⅠ的轉錄（左向）PE(EstablismentPromoter)*CⅠ阻遏與裂解生長有關基因的轉錄，其中轉錄出的CⅠmRNA含有S-D序列，因此有很高的翻譯活性Pint啟動子N蛋白和Cro蛋白被轉錄N蛋白抗終止CⅢ、CⅡ蛋白被轉錄CⅡ作用于PE(PRE)轉錄CⅠ左向轉錄阻遏蛋白結合于OROLCⅠ導致自身從PRM處轉錄?CⅢ、CⅡ蛋白是CⅠ合成的正調控因子，作用于PE處，CⅡ是關鍵?Cro蛋白間接抑制CⅢ、CⅡ的轉錄，直接阻止CⅠ的轉錄2、溶源化的維持—PM啟動子的轉錄?已產生的整合酶使λ整合并實現溶源化（attp、attB）?溶源化的維持需要低水平的CⅠ轉錄，保持自身阻遏循環，這個功能由PM完成?CⅠ蛋白對PM正調控，但PM起始轉錄的CⅠ沒有S-D序列，因此翻譯效率很低，但足以維持溶源狀態?溶源狀態的維持通過CⅠ蛋白結合于OL、OR上而實現溶源周期3、CⅡ、CⅢ蛋白對CⅠ和Cro的影響CⅠ和Cro是λphage的兩種調節蛋白，其中Cro能關閉CⅠ的表達溶源化狀態的進入與否靠二者結合操作子的情況決定，數量是誰占上風的關鍵二者與操作子的親和次序為CⅠ蛋白OL1?OL2?OL3OR1?OR2?OR3Cro蛋白OL3?OL2?OL1OR3?OR2?OR1OL1?OL2?OL3OR1?OR2?OR3結合的結果阻止PL和PR的轉錄CⅡ、CⅢ蛋白是CⅠ和Cro蛋白誰占上風的關鍵因為－－在CⅡ、CⅢ的幫助下CⅠ表達而Cro蛋白遠早于CⅠ蛋白的表達OL1和OR1分別與PL和PR重疊即---CⅠ阻遏二啟動子的能力強★正常情況下，寄主的hfl基因產物大量存在導致Cro占上風因為hfl編碼一種蛋白酶水解CⅡ

?此時Cro蛋白對左右兩個早期操作子親和力的差異，使兩個操縱元初期表達一段時間才關閉

?因此產生足夠的O、P蛋白（復制有關）和PQ，從而使菌4、導致溶源化的因素（1）營養耗竭：寄主能源瀕臨枯竭時，導致cAMP產生等一系列生理變化

*cAMP對hfl基因負調控，使分解CⅡ蛋白的酶大大減少，CⅡ又能抑制該酶，因而CⅡ、CⅢ→CⅠ

體走向裂解（2）MOI值過高（≧10）：MOI指感染時λ噬菌體與細菌的比例，稱感染復數

*CⅡ蛋白其作用的形式是寡聚體形式，單體不穩定無活性

*一兩個噬菌體感染寄主時，產生的CⅡ不足以形成寡聚體

*MOI值過