第六章DNA損傷與修復

DNADamageandRepair胡芳中南大學生物科學與技術學院分子生物學研究中心1

哺乳動物細胞DNA損傷的發生頻率

DNA損傷類型次·細胞-1·天–1單鏈損傷55000脫嘌呤10000脫嘧啶200O6甲基鳥嘌呤3100胞嘧啶脫氨基200胸腺嘧啶乙二醇270胸苷乙二醇702第一節DNA損傷的原因及后果電離輻射氧自由基烷化劑復制錯誤堿基類似物紫外線3一、DNA分子的自發性損傷(一)DNA復制產生誤差模板核酸外切酶活性DNA聚合酶Ⅰ

錯配堿基4

如大腸桿菌堿基配對的錯誤率為10-1-10-2

DNA聚合酶校正后錯誤率為10-5-10-6

復制后經校正系統校正，錯配率為10-9左右5（二）DNA的自發性化學變化

1.堿基的異構互變DNA分子中的4種堿基各自的異構體間都可以自發地相互變化（如酮式-烯醇式或氨基-亞氨基之間的結構互變)，使配對堿基間的氫鍵改變。6堿基的互變異構效應

堿基T和G能夠以酮式或烯醇式兩種互變異構的狀態出現堿基C和A能夠以氨基式或亞氨基式兩種互變狀態出現一般生理條件下，堿基互變平衡反應傾向于酮式或氨基式，故A:T和C

G堿基配對

7互變異構效應引起不正常的堿基配對稀有形式常見形式82.堿基的脫氨基作用堿基的環外氨基有時會自發脫落，從而胞嘧啶(C)變成尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤（G）變成黃嘌呤(X)等。復制時,U與A配對、H和X都與C配對就會導致子代DNA序列的錯誤變化。93．脫嘌呤與脫嘧啶即堿基脫落，是指從DNA上丟失了嘌呤或嘧啶，形成無堿基位點，稱為AP部位（apurine,apyrimidinesite,AP）。10復制時可以插入任何核苷酸。脫落堿基后的脫氧核糖3’端的磷酸二酯鍵易被水解，造成DNA鏈斷裂。在哺乳動物細胞基因組中，每天每個細胞因N-糖苷鍵自發水解約丟失10000個嘌呤堿基和200個嘧啶堿基。11

4．堿基修飾與鏈斷裂細胞在正常生理活動中產生的活性氧會造成DNA損傷，產生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可引起DNA單鏈斷裂等損傷。每個哺乳類細胞每天DNA單鏈斷裂發生的頻率約為五萬次。125.環出效應13二、物理因素引起的DNA損傷(一)紫外線照射引起的DNA損傷

同一條DNA鏈相鄰嘧啶以共價鍵連成二聚體(T-T、C-T、C-C)，導致復制不能進行。

14胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚體15

(二)電離輻射引起的DNA損傷直接效應：DNA直接吸收射線能量而遭損傷；間接效應：DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量而產生具有很高反應活性的自由基，進而損傷DNA。16電離輻射引起DNA損傷的機理17電離輻射引起DNA損傷的機制自由基損害損傷DNA修復系統

MCI假說(mobilechargeinteraction)直接與DNA分子鏈發生作用，作用的靶點是DNA分子中移動的電子。18電離輻射引起DNA損傷的類型產生·OH自由基，導致堿基變化

脫氧核糖分解

DNA鏈斷裂

交聯

DNA鏈交聯和DNA-蛋白質交聯19電離輻射導致DNA鏈的斷裂單鏈斷裂：

雙鏈斷裂：

C20三、化學因素引起的DNA損傷

(一)烷化劑對DNA的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物大分子的親核位點起反應，使DNA發生各種類型的損傷：1．堿基烷基化2.堿基脫落3．斷鏈4.交聯211．堿基烷基化

烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上,烷基化的堿基配對會發生變化.鳥嘌呤胞嘧啶O6-乙基鳥嘌呤胸腺嘧啶222.堿基脫落

烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩定，容易脫落形成DNA上的無堿基位點，復制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。233．斷鏈DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷基化，結果形成不穩定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發生水解，使DNA鏈斷裂。

244.交聯烷化劑有兩類，一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點烷基化；另一類是雙功能基烷化劑，如化學武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩個位點烷基化，結果就能造成DNA鏈內、DNA鏈間或DNA與蛋白質間的交聯。25(二)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷

人工合成的堿基類似物如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤等，其結構與正常堿基相似，進入細胞后能替代正常堿基摻入到DNA鏈中而干擾DNA復制合成，例如5-溴尿嘧啶的結構與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結構時與A配對，但更容易成為烯醇式結構而與G配對，在DNA復制時導致A-T轉換為G-C，26

5-BrdU（5-BrdU-A；5-BrdU-G）酮式烯醇式(二)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷

亞硝酸鹽能使胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶（C→U）

羥胺能使胸腺嘧啶脫甲基變成胞嘧啶（T→C）

黃曲霉素B(G→T)27四、DNA損傷的后果

1.點突變(pointmutation)2.缺失(deletion)3.插入(insertion)4.倒位或轉位(transposition)5.DNA斷裂(DNAbreak)28

DNA突變的類型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-轉換

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)2930第二節DNA修復DNA的修復主要類型:錯配修復直接修復光裂合酶修復切除修復重組修復跨損傷修復(SOS修復)

31一、錯配修復在DNA復制過程中，DNA聚合酶能夠利用其3’一5’外切核酸酶活性去除錯配的核苷酸，但是這種校正作用并不十分可靠，某些錯配的核苷酸可能逃避檢測，出現于新合成的DNA鏈中。錯配修復系統

能夠發現和修復這些錯配核苷酸.錯配的堿基可被錯配修復酶識別后進行修復.32

1.E.coli

錯配修復機制錯配修復系統（Mismatchrepairsystem）DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶)解旋酶Helicase

、SSB、外切核酸酶(Ⅰ、Ⅶ、X和RecJ)、DNApolymeraseⅢ、連接酶MCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutS,L,H掃描新生鏈中錯配堿基識別新生鏈中非m6A的GATC序列酶切含錯配堿基的DNA區段33原核細胞內存在Dam甲基化酶，能使位于5`GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。復制后DNA在短期內（數分鐘）為半甲基化的GATC序列，一旦發現錯配堿基，即將未甲基化鏈切除一段包含錯誤堿基的序列，并以甲基化的鏈為模板進行修復。34錯配修復

35錯配修復(大腸桿菌)Mis-pairedbases3637錯配修復(大腸桿菌)382.真核細胞錯配修復機制3940二.直接修復1.DNA斷裂口直接修復在DNA5’-P端和3’-OH端未受損傷的情況下，連接酶能夠直接修復DNA的斷裂口。412.光復合酶直接修復二聚體423.直接修復烷基化堿基烷基由烷基轉移酶（O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶）去除.這種修復反應的主要特點是,甲基從DNA轉移至烷基轉移酶上,已經甲基化的酶不能再轉變為非甲基化的酶,因此,此種修復又稱為該酶的自殺性修復。434．直接插入嘌呤DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結合，催化游離的嘌呤堿基與DNA無嘌呤部位形成糖苷鍵。且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，使DNA完全恢復。44三、堿基切除修復（baseexcisionrepair，BER）指切除和替換由內源性化學物作用產生的DNA堿基損傷,是切除修復的一種。受損堿基切除是由多個酶來完成的。主要針對DNA單鏈斷裂和小的堿基改變及氧化性損傷。45

當DNA鏈上相應位置的核苷酸發生損傷，導致雙鏈之間無法形成氫鍵，在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復正常結構的過程。46堿基切除修復（人）47四、

核苷酸切除修復

（nucleotideexcisionrepair，NER）體內識別DNA損傷最多的修復通路主要修復可影響堿基配對而扭曲雙螺旋結構的DNA損傷；修復時切除含有損傷堿基的那一段DNA。48核苷酸切除修復(大腸桿菌)UvrA:識別損傷部位UvrB:解旋雙鏈，3’末端內切紫外線誘導uvrA、uvrB、uvrC和uvrD四種基因表達49UvrB3’末端內切UvrC5’末端內切UvrB3’內切UvrC5’內切50UvrD:解旋酶5152核苷酸切除修復(基因組修復–人)53核苷酸切除修復(轉錄偶聯修復-人類)54GGR和TCR的共同修復通路5556五、重組修復大腸桿菌重組修復57根據DNA末端連接需要的同源性，分為同源重組：需要多種蛋白參與,在減數分裂、細胞有絲分裂后期S/G2期起主要作用。非同源末端連接：DNA分子之間不需要廣泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重組時對DNA雙鏈進行連接，在細胞有絲分裂G1/G0期起主要作用。

58同源重組修復DNA雙鏈斷裂（人）59非同源末端連接修復DSB60DNA損傷的原因電離輻射氧自由基烷化劑復制錯誤堿基類似物紫外線61DNA的修復主要類型:錯配修復直接修復光裂合酶修復切除修復重組修復跨損傷修復(SOS修復)

62六、SOS修復

跨損傷修復：正在復制的DNA聚合酶可能遇到尚未修復的DNA損傷，例如胸腺嘧啶二聚體或無嘌呤位點，復制體必須設法跨越損傷進行復制，或者被迫暫停復制。也稱為跨損傷DNA合成。即使細胞不能修復這些損傷，自動防故障系統能夠使復制體繞過損傷部位。這一機制目前僅在大腸桿菌中發現。636465RecA-P的三種功能a、DNA重組活性b、與S.S.DNA結合活性c、proteinase活性當DNA正常復制時（無復制受阻，無DNA損傷，無TTdimer）

RecA-p不表現proteinase活性66當DNA復制受阻/DNAdamaged細胞內原少量表達的RecA-p與ssDNA結合激活RecA-p的proteinase活性修復損傷LexA-p降解RecA-p高效表達SOSopen當DNA復制度過難關后RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff67SOS修復

DNA復制不很嚴格，新合成的DNA容易造成錯誤產生突變。68常見的DNA損傷及其修復機制

DNA損傷因素

DNA損傷類型修復機制X射線、氧自由基、烷化劑自發脫堿基單鏈斷裂、無堿基位點、氧化性堿基（如8-氧鳥嘌呤）尿嘧啶堿基切除修復紫外線和多環芳烴環丁烷嘧啶二聚體等大的紫外線光產物和穩定的多環芳烴化合物等大分子DNA加合物核苷酸切除修復抗癌藥（如順鉑和絲裂霉素）雙鏈斷裂和鏈間交聯雙鏈斷裂修復（同源重組修復和末端連接）復制錯誤和烷化劑堿基錯配和缺失（插入）錯配修復69七、

線粒體DNA損傷和修復哺乳動物的每個細胞中含有2—100個線粒體，每個線粒體有5—13mtDNA分子，mtDNA只占細胞中DNA總量的10%。人mtDNA是獨立于細胞核染色體外的基因組，為環狀雙鏈DNA結構，全長為16569bp。一般認為線粒體基因組DNA突變與人類的衰老、進化、神經退行性病變、糖尿病和惡性腫瘤等有關。7071mtDNA自身的特點決定了它比核DNA對氧化損傷更敏感（1）mtDNA是唯一的核外遺傳物質并暴露于活性氧環境中；（2）線粒體是氧化還原反應的主要場所。mtDNA與氧化還原體系非常接近，

mtDNA呈裸露狀態，缺少組蛋白和非組蛋白對DNA進行保護作用；（3）線粒體本身含有類似微粒體細胞色素P450氧化酶的催化酶，故可直接在線粒體原位激活一些化學致癌物質；（4）mtDNA與富含脂類的線粒體內膜相連，使得mtDNA對脂溶性化學物質及可引起線粒體膜不穩定的因素非常敏感，并往往成為親電子物質首選的靶點；（5）mtDNA的復制酶由核DNA編碼，即使mtDNA損傷十分嚴重，但如果其相關的復制酶編碼基因無損傷或損傷很小，都不會影響損傷的mtDNA復制。這引起mtDNA損傷在細胞內累積，使mtDNA的突變率比核DNA高10倍，而且mtDNA易發生點突變和缺失突變

。72線粒體DNA的氧化損傷: