第五章化學(xué)毒物的一般毒性作用GeneralToxicEffectsofChemicalToxicants主要內(nèi)容急性毒性蓄積作用慢性、亞慢性毒性目標(biāo)1.掌握急性毒性的概念、分級，亞慢性和慢性毒性作用的概念2.熟悉急性、亞慢性和慢性毒性作用的目的和方法3.了解蓄積作用的概念及方法

外源化學(xué)物質(zhì)在一定的劑量、一定的接觸時間和一定的接觸方式下對實驗動物產(chǎn)生綜合毒效應(yīng)的能力稱為化學(xué)毒物的一般毒性(generaltoxicity)，又稱為化學(xué)毒物的基礎(chǔ)毒性(basictoxicity)或一般毒性作用(generaltoxiceffects)。根據(jù)對化學(xué)毒物的接觸時間長短所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，可劃分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。試驗可分為急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗。對化學(xué)毒物的毒性進(jìn)行評價稱為一般毒性評價(evaluationforgeneraltoxicity)。第一節(jié)急性毒性作用及其評價

一、基本概念

急性毒性(acutetoxicity)是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。

凡經(jīng)口接觸和各種方式的注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化合物輸入實驗動物的體內(nèi)。而經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化合物的過程，所以“一次”含有時間因素。如果一種化學(xué)毒物的急性毒性很大，對人類可能產(chǎn)生極大的危險和威脅，或?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境造成潛在的危害。

二、急性毒性實驗?zāi)康呐c常用參數(shù)實驗?zāi)康模?/p>

1.求出受試化合物對一種或幾種實驗動物的致死劑量(通常以LD50為主要參數(shù))，并且對化學(xué)物進(jìn)行毒性分級。

2.通過觀察動物中毒作用的表現(xiàn)、毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物對機體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量反應(yīng)關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險性3.為后續(xù)的重復(fù)劑量實驗、亞慢性和慢性實驗及其他實驗研究提供接觸劑量和觀察指標(biāo)的依據(jù)

4.利用急性毒性試驗方法研究化合物在機體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化過程及其動力學(xué)變化。也可用于研究急救治療措施。

常用參數(shù)：

1.最常用的是半數(shù)致死量(LD50)和急性毒作用帶(Zac)。

實際工作中進(jìn)行急性毒性評價時還常用急性毒作用帶(Zac=LD50／Limac)來表示。Zac值的大小可反映急性閾劑量距離LD50的寬窄，即表示引起實驗動物的死亡劑量與最低毒作用劑量之間劑量范圍的寬窄。Zac值越大，表明化學(xué)物引起急性死亡的危險性越小，反之表明引起急性死亡的危險性越大。

2.目前備受主張的是LD84／LD16(或LC84／LC16)的比值。它是代替Zac是一種靈敏性好、重復(fù)性強而且容易求出的參數(shù)，可以較好地反映急性毒性特征。

3.當(dāng)比較兩種(或以上)LD50相同或近似的化學(xué)毒物的致死毒性時，還可使用該化學(xué)毒物的劑量-反應(yīng)曲線斜率(即劑量-死亡曲線的概率單位直線的斜率)表示。用以評價化學(xué)毒物急性毒性會更為合理。

4.皮膚-皮下系數(shù)

皮膚LD50/皮下LD50

反映化合物經(jīng)皮吸收的危險性5.經(jīng)口-腹腔注射系數(shù)經(jīng)口LD50/腹腔注射LD50

反映化合物經(jīng)口吸收的危險性三、急性毒性分級..\國內(nèi)外有關(guān)化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn).doc四、急性毒性試驗設(shè)計

實驗動物染毒途徑

染毒劑量

觀察周期觀察指標(biāo)的選擇計算方法和評價

(一)實驗動物

急性毒性試驗要求選擇對化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的實驗動物。然而，在注重選擇對化學(xué)物毒性反應(yīng)敏感的動物物種的同時，還得考慮動物易于獲得、品系純化、價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。

1.實驗動物的種屬不同種屬的動物對化學(xué)物的反應(yīng)可能有很大的差別，最好用兩種種屬的動物，包括嚙齒類(rodentspecies)和非嚙齒類(nonrodentspecies)。

2.實驗動物的性別急性毒性試驗的主要內(nèi)容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性試驗對動物性別要求為雌雄各半。

3.動物數(shù)量與隨機分組急性毒性試驗要求大鼠、小鼠等小動物數(shù)量為每組10只，狗等大動物也應(yīng)每組6只。在動物分組中應(yīng)嚴(yán)格遵循隨機化的原則。

一般4-6組

4.禁食經(jīng)口染毒的試驗，要求動物實驗前禁食，以免胃內(nèi)殘留食物對化學(xué)毒物毒性產(chǎn)生干擾。大鼠、小鼠隔夜禁食大動物染毒前部喂食，染毒后繼續(xù)禁食3-4小時四、急性毒性試驗設(shè)計

(二)染毒途徑的選擇

進(jìn)行化學(xué)毒物急性毒性測試時應(yīng)考慮人在生產(chǎn)和生活環(huán)境中接觸該化學(xué)毒物的情況，通常根據(jù)實驗?zāi)康摹⒒瘜W(xué)毒物的性質(zhì)和用途、人類實際接觸途徑和方式來選擇染毒途徑(exposureroutes)。有時可根據(jù)具體情況，選用腹腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下和皮內(nèi)等注射途徑。以人實際接觸的方式來染毒

1.經(jīng)口(胃腸道)染毒(oralexposure)生產(chǎn)和生活環(huán)境中許多化學(xué)毒物，可以通過污染飲水和食物經(jīng)胃腸道進(jìn)入機體。經(jīng)口(胃腸道)是急性毒性試驗中最常用的染毒途徑，具體的染毒方式有：灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方法。

2.經(jīng)呼吸道染毒(inhalation)以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在于車間空氣中的化學(xué)毒物和評價環(huán)境空氣污染物時，常采用經(jīng)呼吸道染毒的途徑。呼吸道染毒方式分為兩種：一種是靜式吸入，另一種是動式吸入。

3.經(jīng)皮膚染毒(dermalexposure)液態(tài)、氣態(tài)甚至粉塵狀態(tài)的化學(xué)毒物均可能通過皮膚接觸而吸收，尤以職業(yè)接觸為多見。

4.經(jīng)注射途徑染毒(ingestion)采用注射途徑進(jìn)行外來化合物的急性毒性試驗，主要用于比較毒性研究，以及化合物的代謝、毒物動力學(xué)和急救藥物篩選等研究。注射途徑可選擇腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射皮下注射等。靜脈注射方式包括大鼠和小鼠尾靜脈、兔耳靜脈。四、急性毒性試驗設(shè)計

(三)染毒劑量與分組

首先了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點、沸點、比密、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號及純度，雜質(zhì)成分與含量等。其次，確定使用哪一種計算方法求LD50，然后再設(shè)計劑量分組。LD50的計算方法常用寇氏法、概率單位法、霍恩法等。設(shè)計劑量時有兩種方式：

1.有相關(guān)毒性資料可供參考者查閱文獻(xiàn)，找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，以文獻(xiàn)資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所測得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。以此預(yù)期值作為待測化學(xué)物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設(shè)計1-2個劑量組作為預(yù)試驗劑量。每個劑量組間的組距可以大些，以便尋找出受試物的致死劑量范圍。

2.沒有毒性資料可供查閱者

在完全沒有毒性資料參考的情況下，一種備受推薦的方法是進(jìn)行最大耐受量試驗(limittests)，該法多被用于食品、日用化學(xué)品等一些被視為毒性很低的化學(xué)物質(zhì)的毒性鑒定。依據(jù)各類化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，以最大耐受量作為試驗劑量，如WHO規(guī)定經(jīng)口為5g／kg、經(jīng)皮膚接觸為2g／kg、經(jīng)呼吸道為5mg／L。

另一種方法是設(shè)定以1mg／kg為最低劑量組(lg1=0)，其它劑量組依次為對數(shù)值0.6、1.2、1.8、2.4，其實際劑量分別為4mg／kg、16mg／kg、64mg／kg和128mg／kg，進(jìn)行預(yù)試驗。若預(yù)試驗提示受試物的致死劑量范圍較窄，也可將組距縮小為對數(shù)值0.2，即劑量組間比值為1.6，即lg40=1.6。通過以上方法找出受試物的大致致死范圍后(即死亡率從0％～10％至90％～100％)，即可設(shè)計正式試驗的劑量和分組。

一般來說，根據(jù)試驗設(shè)計所選用的LD50計算方法來確定組數(shù)。例如概率單位法、寇氏法一般設(shè)6～10個劑量組；霍恩法固定設(shè)4個劑量組。可根據(jù)以下公式計算出劑量分組：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i為組距(相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差)；n為設(shè)計的劑量組數(shù)。

求得i值后，以最低劑量組(LD0或LD10)的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對數(shù)劑量，依此類推直至最高劑量組，查各自的反對數(shù)即得出各組劑量的真實值。四、急性毒性試驗設(shè)計

(四)試驗周期與毒效應(yīng)觀察化學(xué)毒物的LD50(LC50)的測定一般要求計算實驗動物接觸受試物后14天內(nèi)的總死亡數(shù)。值得注意的是：不同的化學(xué)物其中毒癥狀出現(xiàn)的時間和特點各有不同，而且引起動物死亡的時間也存在很大的個體差異。

觀察實驗動物以化學(xué)毒物染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)，對于了解化學(xué)毒物的急性毒作用特征非常重要，可以補充單純以LD50(LC50)表示急性毒性的不足。

1.中毒癥狀試驗過程應(yīng)詳細(xì)地觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒癥狀、發(fā)生的時間、癥狀發(fā)展的經(jīng)過、死亡前的特征以及死亡時間等。

2.體重在觀察實驗動物中毒癥狀的過程中，應(yīng)同時觀察體重的變化。

3.病理檢查及其它指標(biāo)急性毒性試驗中，對死亡的動物均應(yīng)及時進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查，肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其它改變，對有改變的臟器進(jìn)行取材做組織病理學(xué)檢查。

4.死亡和死亡時間重點觀察和記錄每只動物死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時間以及各個劑量組動物的死亡數(shù)。

急性毒性試驗結(jié)束時，除了報告該化學(xué)毒物的LD50值和急性毒性定級外；還應(yīng)對其它的毒性參數(shù)和中毒特征加以報告。第二節(jié)蓄積毒性作用及其評價一、基本概念化學(xué)毒物進(jìn)入機體后，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化以代謝產(chǎn)物或化學(xué)物原型排出體外。但是，當(dāng)化學(xué)毒物反復(fù)多次給動物染毒，化學(xué)毒物進(jìn)入機體的速度(或總量)超過代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時，化學(xué)毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)毒物的蓄積作用(accumulation)。

化學(xué)毒物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫(depot)。機體常見的儲存庫有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。蓄積是化學(xué)毒物分布的一種特殊方式。出現(xiàn)蓄積作用時，化學(xué)毒物在體內(nèi)的分布常表現(xiàn)為相對集中的形式。

蓄積作用實際上有二個含義：

①當(dāng)實驗動物反復(fù)多次接觸化學(xué)毒物一定時間之后，用化學(xué)分析方法能夠測得機體內(nèi)(或某些組織器官內(nèi))存在該化學(xué)毒物的原型或其代謝產(chǎn)物時，稱之為物質(zhì)蓄積(materialaccumulation)，如機體生物材料(血、尿等)檢定重金屬鉛、鎘、錳、汞含量升高；②有的化學(xué)毒物在機體內(nèi)雖不能被測出，然而在長期接觸的情況下機體可以出現(xiàn)慢性中毒的現(xiàn)象，這種情況稱為功能蓄積(functionalaccumulation)。二、蓄積毒性試驗方法及其評價化學(xué)毒物的蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此研究化學(xué)毒物在機體內(nèi)的蓄積性是評價化學(xué)毒物能否引起潛在慢性毒性的依據(jù)之一，也是衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制訂過程選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)。

蓄積毒性試驗是研究化學(xué)毒物基礎(chǔ)毒性的重要內(nèi)容之一，目的是通過試驗求出蓄積系數(shù)K，了解化學(xué)毒物蓄積毒性的強弱，并為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。當(dāng)大鼠經(jīng)口LD50大于5000mg／kg，或已作過代謝試驗有半減期(t1/2)數(shù)據(jù)者，可不做蓄積毒性試驗。

蓄積毒性的研究方法有多種，常用的方法是：(一)蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)法是一種以生物效應(yīng)為指標(biāo)，用經(jīng)驗系數(shù)(K)評價蓄積作用的方法，即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)(或死亡)進(jìn)行比較。蓄積系數(shù)(accumulationcoefficient)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量[ED50(n)]與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量[ED50(1)]的比值，

K=ED50(n)/ED50(1)

在毒理學(xué)領(lǐng)域研究化學(xué)毒物的蓄積作用時多選擇小鼠或大鼠為實驗動物，以動物死亡一半為效應(yīng)指標(biāo)，那么上式可改寫為：

K=LD50(n)/LD50(1)

K值越小，表示化學(xué)毒物的蓄積性越大。

蓄積系數(shù)法常用的實驗方案主要有：

1.固定劑量法一般常選用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法進(jìn)行染毒。先求出LD50，然后選取相同條件的40只(或更多)實驗動物，分為兩組，一為染毒組，一為對照組，每組至少20只，雌雄各半。染毒組每日定時、定量給予受試化學(xué)物，每日染毒劑量固定，劑量設(shè)計在1/20-1/5之間，且記錄染毒動物死亡數(shù)，至累計一半動物死亡時終止實驗，計算K值。若累計染毒劑量已達(dá)5LD50，也可終止實驗，此時K大于等于5

2.劑量遞增法試驗方案同上，僅是實驗開始時染毒組按0.1LD50劑量給予化學(xué)毒物染毒，以4天為一期，按一定比例（一般是1.5倍）增加染毒劑量。

3.劑量固定的20天蓄積法該法為我國《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法》(GB15670-1995)中關(guān)于蓄積毒性試驗的方法之一，也是基于蓄積系數(shù)的原理而設(shè)計的。

(二)生物半減期法生物半減期(biologicalhalf-life，t1/2)法是用毒物動力學(xué)原理描述化學(xué)毒物在機體內(nèi)的蓄積作用。外源化學(xué)物在體內(nèi)消除一半所用的時間。

化學(xué)毒物在體內(nèi)蓄積的速度和量與機體單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速度以及清除速度有關(guān)。當(dāng)化學(xué)毒物的吸收過程與代謝轉(zhuǎn)化-清除的過程達(dá)到平衡時，其蓄積量基本上不再增加。一般來說，t1/2較短的化學(xué)毒物達(dá)到蓄積極限所需的時間也短，t1/2長者達(dá)到蓄積極限的時間也長。化學(xué)毒t1/2與其在體內(nèi)蓄積過程的典型曲線關(guān)系。

一種化學(xué)毒物若以t1/2相等的時間間距染毒，其在體內(nèi)經(jīng)過6個t1／2的接觸期就可以基本上達(dá)到蓄積的極限，此時理論蓄積量達(dá)到極限值的98.4%。此后即使繼續(xù)接觸該物質(zhì)，機體內(nèi)的蓄積量基本上也不會再增加。

(三)蓄積率外來化學(xué)物的蓄積性試驗也可通過蓄積率測定來完成。蓄積率是指在一定時間內(nèi)，外來化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積量與同一期間進(jìn)入機體總量的百分比。蓄積率越高，該化學(xué)物質(zhì)蓄積可能性也大。第三節(jié)亞慢性、慢性毒性作用及其評價一、基本概念及試驗?zāi)康?.亞慢性毒性(subchronictoxicity)是指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)接觸較長時間、較大劑量的化學(xué)毒物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。接觸時間通常指介于單次染毒和10％動物壽命的范圍（大、小鼠一般90天）。較大劑量是相對于低劑量而言，沒有明確的劑量范圍下限，劑量上限一般小于急性LD50。

試驗?zāi)康氖牵孩佾@取亞慢性毒性的參數(shù)如最大無作用劑量(NOAEL)和最小有作用劑量，估測閾劑量，為慢性毒性試驗和致癌試驗的劑量設(shè)計提供依據(jù)；②了解亞慢性染毒情況下化學(xué)毒物的毒作用性質(zhì)、特點和特異靶器官，并為慢性毒性試驗選擇合適的觀察指標(biāo)提供依據(jù)。此外，亞慢性毒性試驗也可作為慢性毒性試驗的預(yù)備試驗。

2.慢性毒性(chronictoxicity)是指人或?qū)嶒瀯游镩L期(甚至終生)反復(fù)接觸低劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

許多化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中的濃度并不具有明顯的急性毒性，然而在長期慢性接觸的情況下，其潛在的累積的效應(yīng)變得明顯起來，如急性接觸二惡英(dioxin)和多氯聯(lián)苯(PCBs)。

試驗的目的

確定長期接觸化學(xué)毒物造成機體損害的最小作用劑量或閾劑量和對機體無害的最大無作用劑量，闡明化學(xué)毒物慢性毒作用的性質(zhì)、靶器官和中毒機制，為制定化學(xué)物質(zhì)的人類接觸安全限量標(biāo)準(zhǔn)如最高容允許濃度(MAC)和每日容許攝入量(ADI)以及進(jìn)行危險度評定提供毒理學(xué)依據(jù)。

二、亞慢性毒性試驗設(shè)計(一)實驗動物實驗動物應(yīng)考慮它對化學(xué)毒物的代謝過程、生理反應(yīng)和生化特性基本上與人接近，而且在急性毒性試驗中證明是對受試物敏感的物種和品系。一般要求選擇兩個動物種屬，即嚙齒類(如大鼠、家兔)和非嚙齒類(如狗、猴)，以全面了解化學(xué)毒物的毒性特征。種系選擇多用純系動物，如大鼠常用Wistar和Sprague-Dawley品系，小鼠選昆明等。

試驗要求動物雌雄各半，但在一些特殊研究中也可以僅使用一種性別的動物，如研究化學(xué)毒物的性腺毒性或生殖毒性。此外，由于亞慢性試驗期較長，所以一般選擇剛斷乳的健康動物，如體重為15g左右的小鼠，100g左右的大鼠。各試驗組及對照組動物數(shù)應(yīng)相同，體重(年齡)相近，同組動物體重相差不超過平均體重的10％，組間平均體重相差不超過5％。

小動物(如大鼠、小鼠)每組不應(yīng)少于20只，大動物(如狗、猴)每組不少于6～8只。若試驗要求在試驗中期處死部分動物進(jìn)行病理學(xué)觀察，則每組動物數(shù)要相應(yīng)增加。

亞慢性毒性試驗的期限“多日”的確切天數(shù)，至今尚無完全統(tǒng)一的認(rèn)識。一般認(rèn)為在環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)中所要求的連續(xù)接觸為3～6個月，而在工業(yè)毒理學(xué)中認(rèn)為1～3月即可。現(xiàn)有學(xué)者主張進(jìn)行實驗動物90天喂飼試驗為亞慢性毒性試驗，即將受試物混合物飼料或飲水中，動物自然攝取連續(xù)90天。

(二)染毒途徑

染毒途徑的選擇應(yīng)盡量采用人群實際接觸的途徑和方式，并與預(yù)期進(jìn)行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚染毒三種途徑為多。染毒頻率(dosingfrequency)一般每日一次，經(jīng)口染毒分為喂飼法和灌胃法。經(jīng)呼吸道吸人染毒時間通常為每日6小時，工業(yè)毒物可以縮短至1小時或延長，環(huán)境污染物可延長至8小時。經(jīng)皮染毒一般每天6小時，而且每周應(yīng)對染毒部位脫毛一次。

一般設(shè)3個劑量組和1個陰性對照組，必要時再加1個溶劑對照組。

低劑量組的劑量應(yīng)相當(dāng)于亞慢性的閾劑量水平或未觀察到作用水平，

中劑量組動物以出現(xiàn)輕微中毒效應(yīng)為度，相當(dāng)于有害作用的最低劑量。

高劑量組的染毒劑量應(yīng)使動物在染毒期間產(chǎn)生明顯的中毒癥狀或某項觀察指標(biāo)發(fā)生明顯的改變，但不會引起動物死亡，即使有死亡，也應(yīng)少于10％的動物數(shù)。

通常可根據(jù)兩個數(shù)據(jù)來確定最高劑量，即以該化學(xué)物急性毒性的閾劑量(同一動物品系和同樣的染毒途徑)或以該化學(xué)物的1/20～1/5LD50作為最高染毒劑量；最低劑量組的動物應(yīng)無中毒反應(yīng)或僅有極其輕微的反應(yīng)，相當(dāng)于亞慢性的閾劑量或NOAEL水平。

(四)觀察指標(biāo)

通常包括一般性指標(biāo)、特異性指標(biāo)和組織病理學(xué)檢查。

1.一般性指標(biāo)一般性指標(biāo)主要指非特異的觀察指標(biāo)，能綜合反映化學(xué)毒物對機體的毒作用，而且常常是敏感的綜合毒效應(yīng)指標(biāo)。在試驗過程中，只要詳細(xì)記錄，仔細(xì)分析，往往可以從中發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)毒物的毒性特征。這些指標(biāo)通常包括：

①動物體重：實驗動物在亞慢性方式接觸外來化合物過程中，有多種因素均可影響動物體重的增長，包括食欲變化、消化功能變化、代謝和能量消耗變化等。

②食物利用率：亞慢性試驗期間必須注意觀察并記錄動物的飲食情況，在此基礎(chǔ)上計算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)。③癥狀：實驗動物在接觸外來化合物過程中所出現(xiàn)的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間均應(yīng)記錄和分析。

④臟器系數(shù)：或稱臟/體比值，是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g體重計。如肝/體比，即(全肝濕重/體重)

100。⑤生化檢驗指標(biāo)：常規(guī)生化檢查一般包括血象、肝、腎功能的檢測，所選指標(biāo)多具篩檢性。

2.病理學(xué)檢查病理組織學(xué)檢查是亞慢性毒性試驗中最重要的檢測指標(biāo)之一，目的是確定化學(xué)毒物對機體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度，從病理學(xué)角度尋找化學(xué)毒物與病理改變的劑量效應(yīng)關(guān)系，為了解化學(xué)毒物的毒效應(yīng)及其機制提供依據(jù)。

病理學(xué)檢查包括：大體檢查、常規(guī)病理組織學(xué)檢查、酶組織化學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查等，分別從大體、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至分子水平等多個方面發(fā)現(xiàn)化學(xué)毒物的毒效應(yīng)。3.特異性指標(biāo)特異性指標(biāo)可以反映受試物的毒作用本質(zhì)，也有助于取得中毒機制的線索。但是在中毒機制不明確的情況下往往難以選擇。一般從分析受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或急性或亞急性毒性特征時發(fā)現(xiàn)線索

三、慢性毒性實驗設(shè)計

慢性毒性是指以低劑量外來化合物長期給予實驗動物接觸，觀察其對實驗動物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。是化學(xué)毒物一般毒性評價程序中的最重要的實驗，也是最后階段的試驗，在化學(xué)物質(zhì)安全性毒理學(xué)評價中具有十分重要的作用。該實驗周期長、目的性強，其結(jié)果是制定化學(xué)物質(zhì)安全限量標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)。

(一)實驗動物與亞慢性毒性試驗相同。為減少個體差異，最好用純系動物并將同窩動物均勻地分配到各劑量組和對照組。

一般要求選用兩個種屬的實驗動物，即嚙齒類和非嚙齒類，目前對嚙齒類動物首選大鼠，非嚙齒類為狗或猴。每個劑量組的動物數(shù)應(yīng)滿足試驗結(jié)束時數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理的要求，如大鼠40～60只，狗8～10只，雌雄各半。慢性毒性試驗期長，故應(yīng)選擇年齡較小的動物，一般選初斷奶的大鼠或小鼠，即小鼠出生后3周(體重約10～15g)，大鼠出生3～4周(體重約50～70g)，狗一般在4～6月齡時開始試驗。

(二)實驗?zāi)康穆远拘詫嶒炇谴_定外來化合物的毒性下限，即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量。為進(jìn)行該化合物的危險性評價與制定人接觸該化合物的安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供毒理學(xué)依據(jù)，如最高容許濃度和每日容許攝入量等。

(三)染毒時間與期限

一般認(rèn)為工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學(xué)者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應(yīng)，以及求出閾劑量或無作用劑量。

慢性毒性試驗多為經(jīng)口與經(jīng)呼吸道接觸。經(jīng)呼吸道接觸，每日接觸時間，依實驗要求而定。工業(yè)毒物的試驗通常每日吸入4～6小時。環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時或更長。

(四)劑量分組劑量設(shè)計一般以亞慢性毒性試驗數(shù)據(jù)(閾劑量或最大無作用劑量)、人群期望接觸劑量等為依據(jù)。理想的劑量選擇應(yīng)能體現(xiàn)：①一種毒性物質(zhì)的劑量-反應(yīng)關(guān)系；②最大無作用水平(NOAEL)；③最高劑量組能觀察到某些毒作用所致變化。

慢性毒性試驗一般設(shè)3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設(shè)1個溶劑對照組，一般認(rèn)為以亞慢性毒性試驗閾值的1/5～1/2為其最高劑量組，以亞慢性閾值的1/50～1/10為慢性試驗的中間劑量組，以1/100亞慢性閾值為最低劑量組。

在沒有亞慢性試驗資料的情況下，可以參照LD50值設(shè)計劑量組，如以1/10LD50為最高劑量，以1/100LD50為預(yù)期慢性閾劑量，1/1000LD50為最大無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應(yīng)當(dāng)大一些，組間劑量差一般以5～10倍為宜，最低不小于兩倍，以利于求出劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有助于排除實驗動物的個體敏感性差異。

(五)觀察指標(biāo)

觀察指標(biāo)的選擇必須以亞慢性毒性試驗所提供的毒效應(yīng)和靶器官為基礎(chǔ)，包括體重、食物攝取、臨床癥狀、行為改變、血象和血液生化、尿的性狀及生化成分，重點是在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標(biāo)。優(yōu)先采用亞慢性毒性試驗篩選出來的敏感指標(biāo)或特異性指標(biāo)。必須指出的是，在慢性毒性實驗或／和致癌試驗中，病理組織學(xué)檢查是非常重要的、必不可少的指標(biāo)，在現(xiàn)行研究條件下有時成為惟一的王牌指標(biāo)。

一些觀察指標(biāo)變化甚微，加上實驗周期長，動物容易發(fā)生自發(fā)性疾病，干擾實驗結(jié)果的正確判斷，為此應(yīng)注意三點：一是試驗前應(yīng)對一些預(yù)計觀察指標(biāo)，尤其是血、尿常規(guī)及重點測定的生化指標(biāo)進(jìn)行正常值測定，廢棄個體差異過大的動物；二是在接觸外來化合物期間進(jìn)行動態(tài)觀察的各項指標(biāo)，應(yīng)與對照組同步測定；三是各化驗測定方法應(yīng)精確、可靠、且進(jìn)行質(zhì)量控制。

四、亞慢性、慢性毒性作用評價包括三個步驟：①明確化學(xué)物質(zhì)的毒效應(yīng)。②根據(jù)在試驗早期和最低劑量組出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)變化，確定毒效應(yīng)的敏感指標(biāo)，并依據(jù)指標(biāo)出現(xiàn)變化的情況來確定閾劑量和/或最大無作用劑量。③危險性評價

根據(jù)閾劑量和/或最大無作用劑量，對化學(xué)毒物的慢性毒性作出評價。根據(jù)急性閾劑量、亞慢性閾劑量計算毒作用帶，參考下表對亞慢性中毒的危險性進(jìn)行估計。

對于易揮發(fā)的液態(tài)化學(xué)物，經(jīng)呼吸道進(jìn)入機體時，應(yīng)參考慢性吸入中毒可能指數(shù)(riskindexofchronicinhalationpoisoning，Ich)進(jìn)行危險性評價。Ich是該化學(xué)物在20℃時的蒸氣飽和濃度與慢性閾濃度的比值(Ich=C20℃/Limch)。Ich越大，產(chǎn)生慢性吸入中毒的危險性越大。第四節(jié)化學(xué)毒物所致機體損傷的組織病理學(xué)改變及其評價

通過研究化學(xué)毒物引起機體靶器官系統(tǒng)損傷的基本病變、病理過程及機制，從形態(tài)學(xué)角度來觀察和研究毒作用部位、方式、損害性質(zhì)及程度。這種研究環(huán)境化學(xué)毒物引起機體損傷或發(fā)生疾病的病理學(xué)又稱為毒理病理學(xué)(toxicologicalpathology)。在我國和世界上許多國家有關(guān)農(nóng)藥、食品、化妝品、藥物等化學(xué)物質(zhì)安全性毒理學(xué)評價程序中，毒理病理學(xué)檢查均被列為必檢的項目之一。毒理病理學(xué)檢查的大體和光鏡觀察是研究化學(xué)毒物急性、亞慢性和慢性毒性作用的基本項目，在致癌試驗中更是經(jīng)典的、具決定性意義的指標(biāo)之一。組化、電鏡、放射自顯影及分子生物學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)領(lǐng)域的滲透大大提高了病理形態(tài)觀察的靈敏度，從而使人類對毒作用的性質(zhì)特征及機制的認(rèn)識上升到一個新的高度，對毒作用閾值和NOAEL的確定也有了新的依據(jù)。

一、化學(xué)毒物對靶器官系統(tǒng)損傷的病理學(xué)改變

具有多器官或多系統(tǒng)毒性，僅在某些器官和系統(tǒng)的損傷相對更為嚴(yán)重；另一方面，靶器官損傷表現(xiàn)出來的病理組織學(xué)改變具有多樣性和復(fù)雜性，可囊括全部的基本病理過程及病變的主要類型。此外，化學(xué)毒物所致病理損傷，還具有特殊性，即涉及化學(xué)毒物的致突變性、致畸性和致癌性。

(一)化學(xué)毒物所致靶器官損傷的基本病變

化學(xué)毒物引起中毒性損傷的病理改變多為非特異性的，與任何其他因素引起各類疾病的病變類型沒有明顯區(qū)別。一般包括：1.細(xì)胞損傷是全身各種組織細(xì)胞，特別是具有高分化特殊功能的實質(zhì)細(xì)胞，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞和心肌細(xì)胞等在中毒時最常出現(xiàn)的病變形式。其本質(zhì)是化學(xué)毒物作用下細(xì)胞生化代謝發(fā)生異常或停止，細(xì)胞內(nèi)生命活動的嚴(yán)重障礙和基本結(jié)構(gòu)的破壞崩解。病毒性肝炎的凋亡小體（鏡下）

凋亡是單個細(xì)胞的程序性死亡，而不是大批細(xì)胞死亡。本例肝細(xì)胞由于肝炎病毒的損傷而個別死亡。細(xì)胞染成粉紅色，細(xì)胞核消失。肝小葉中央萎縮

圖示中央靜脈旁的肝小葉中央部，肝細(xì)胞體積縮小或缺氧壞死。染成淡黃褐色的是萎縮的或死亡的細(xì)胞進(jìn)行自體吞噬所積累的脂色素。腎梗死的凝固性壞死（大體）

大量細(xì)胞突然死亡可根據(jù)損傷的性質(zhì)，組織的類型，作用的時間長短來分類。本例是凝固性壞死,是缺血壞死（血液供應(yīng)減少導(dǎo)致組織缺氧）的典型方式。圖示腎皮質(zhì)蒼白色的楔形壞死灶（梗死灶）。腎梗死的凝固性壞死（鏡下）鏡下，左邊腎皮質(zhì)缺氧壞死，細(xì)胞染色變淡。中間有出血區(qū)，細(xì)胞壞死不徹底。最右邊是正常的腎皮質(zhì)。本圖為凝固性壞死。細(xì)胞損傷輕者出現(xiàn)變性(degeneration)、重者表現(xiàn)壞死(necrosis)。變性包括混濁腫脹、水樣變性、脂肪變性、玻璃樣變性、淀粉樣變、神經(jīng)髓鞘變性、糖原浸潤和色素沉著等。變性是可逆的，但演變?yōu)閴乃绖t不可逆。細(xì)胞發(fā)生壞死是中毒性損傷最嚴(yán)重的病理表現(xiàn)。2.血液循環(huán)障礙

許多化學(xué)毒物可直接或間接損傷毛細(xì)血管、小動

脈和小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜或平滑肌細(xì)胞，或引起血液成分、特別是局部微循環(huán)或全身性血液循環(huán)障礙，最常表現(xiàn)為各種形式的充血、瘀血、出血、水腫、血栓形成和彌漫性血管內(nèi)凝血。

3.炎癥炎癥是生命機體對異物入侵的一種普遍防衛(wèi)反應(yīng)，在化學(xué)毒物引起的中毒性損傷中很常見。外周血中性白細(xì)胞增多（鏡下）

急性炎癥的標(biāo)志是炎細(xì)胞增多,也許最簡單的依據(jù)是外周血的白細(xì)胞計數(shù),圖示為鏡下白細(xì)胞增多視野。滲出（鏡下）

圖示大量液體，纖維素和中性粒細(xì)胞滲出到肺泡腔。肺孢子蟲病（大體）圖示卡氏囊蟲性肺炎患者的肺，質(zhì)硬如肝，見于免疫抑制患者，特別是艾滋病患者。

急性小葉性肺炎（鏡下）

本例為一伴高熱的急性小葉性肺炎患者。鏡下見大量中性粒細(xì)胞填充肺泡腔，肺泡壁毛細(xì)血管擴張表明急性炎癥的舒血管過程。

4.纖維化和硬化多見于慢性中毒、反復(fù)多次中毒或嚴(yán)重的急性中毒之后，是在組織細(xì)胞變性壞死和/或炎癥的基礎(chǔ)上綜合演變的結(jié)果，其本質(zhì)是實質(zhì)細(xì)胞因中毒損傷而大量破壞消失以后，間質(zhì)纖維成分明顯增多以代替實質(zhì)的過程。

5.腫瘤確定的人類致癌物有60種，還有一批為數(shù)不少(約800種)的動物致癌物和可疑致癌物，其中最重要的是肺癌、肝癌和膀胱癌。

(二)組織細(xì)胞對毒作用反應(yīng)的一般規(guī)律組織細(xì)胞對毒作用的反應(yīng)通常有以下三個特點：

1.具有特異的靶器官和靶部位最常見的靶器官是肝、腎、神經(jīng)和造血組織。如鉛化合物進(jìn)入機體，可引起多器官損害，但是其主要靶器官是紅細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟。不同的化學(xué)物質(zhì)對機體產(chǎn)生損害的靶