細胞凋亡檢測方法的研究進展

細胞死亡是由基因控制的、高度有序的細胞活動死亡過程，即過程性細胞死亡（pcd）。細胞在一定的生理或病理狀態下,遵循自身的程序,自己結束自己生命的過程,最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體,而被其他細胞吞噬,不導致炎癥反應。細胞凋亡不受到外損傷因素直接導致的被動改變而屬機體自身的生理活動,是一種基因指導的生物過程,是對外部或內部的死亡信號作出的反應,貫穿從受精、發育、成熟、衰老的整個生命過程。近年來一直是生命科學和醫學領域各專業的研究熱點。隨著對凋亡研究的不斷深入,各種各樣檢測凋亡的新技術和新方法相繼建立,因此在我們的研究中選擇哪種凋亡檢測方法非常關鍵。本文就細胞凋亡的概況及四種細胞凋亡的檢測方法做一下比較,以期為將來的研究打下理論基礎。1凋亡受體的激活Kerr等(1972年)根據形態學的變化,首先提出和描述了一種不同于細胞壞死的死亡方式即細胞凋亡。細胞凋亡的發生是一個很復雜的過程,基本過程大體可以分為:起始階段、效應階段和清除階段。它的發生是漸進性分階段的過程,我們可以對其事件的發生大致排一個先后順序:首先是凋亡受體的激活或凋亡誘導因子的活化,然后通過不同途徑進行傳導,接下來是線粒體的變化及其caspases的活化,這是凋亡的前期事件;接著隨著活化核酸內切酶激活,細胞出現凋亡特有的表現:磷脂酰絲氨酸外翻、細胞皺縮、染色質凝集等,直至形成凋亡小體。細胞凋亡的特征:早期形態學改變是細胞皺縮,細胞體積減小,繼而細胞核染色質濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,呈新月狀、塊狀活破裂狀;然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,最終細胞核裂解成若干碎片,細胞膜將胞質和染色質斷片包裹,胞漿內形成多個膜結構尚完整的“小泡”及“凋亡小體”。這不同于細胞壞死表現為細胞膜通透性增高,致使細胞腫脹,細胞器變形腫大,最后細胞溶解破裂,溶酶體酶泄漏,并常引起炎癥反應。細胞凋亡在生化學上表現為DNA瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀條帶;細胞凋亡無炎癥反應。死亡的細胞碎片很快被巨噬細胞或鄰近細胞清除,不留瘢痕,不影響其他細胞的正常功能。2檢測細胞死亡的方法2.1電鏡觀察細胞凋亡電鏡形態學檢測能夠為細胞凋亡提供直觀的證明,是觀察細胞形態變化的最好方法,可清楚地觀察到細胞核及亞結構其變化。通過電鏡可以觀察到有典型的凋亡細胞出現,其特征是細胞核體積縮小,染色質濃縮致密,并沿核膜分布形成新月體狀,細胞膜微絨毛消失,但細胞漿內的各種細胞器基本正常。而普通光學顯微鏡只可以觀察到細胞凋亡的大體形態胞膜起泡現象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態學變化大多發生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意。電鏡形態學觀察是迄今為止判斷凋亡最經典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。操作方法:取2mm×2mm×2mm的肌組織塊,固定,脫水,浸透,包埋,固化,切片,染色等步驟,透射電鏡下觀察。對其過程中的各項條件更加嚴格、更加精細。電鏡檢測細胞凋亡的缺點是:(1)只能定性,不能定量;(2)切片標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高。此方法是判斷細胞有無凋亡發生的一種簡便方法,且費用低廉。缺點:(1)特異性較差,特征性的(180~200)bpDNA梯帶的出現并非凋亡所獨有,另外在某些罕見的情況下細胞發生凋亡可無DNA斷裂;(2)不易定量;(3)靈敏性較差,耗時長,且要求大量細胞同時發生凋亡才能使電泳清晰2.3凋亡的分析方法(1)流式細胞儀的工作原理。用流式細胞術分析檢測細胞凋亡時,必須用熒光染料對細胞進行染色。常用的染料有碘化丙啶(P1),溴化乙啶(EB),丫啶橙,Hoechst33258等。經熒光染料標記過的細胞樣品要求制成單細胞懸液,以一定的流速經過噴嘴,流速的選擇與檢測的目的有關,當液體剛好經過光源發出的激光形成的聚焦區,此時,標記的熒光染料在激發光的激發下發射出特異顏色的熒光信號和散射光信號,信號的強弱與細胞內待測組分的含量呈正比。熒光信號和散射光信號經過光電倍增管和光電探測器接收后轉換成電脈沖,送入計算機處理,應用不同的分析軟件可分析樣品的各種參數,最后以直方圖或三維圖的形式顯示出來。此外,還可以用不同的標記物進行雙參數、三參數、甚至多參數的分析。另外,運用流式細胞儀可根據細胞的形態或標記染料的熒光信號對細胞進行分選,以便下一步進一步研究的需要。目前在基礎研究中,凋亡的定量分析主要依靠流式細胞術。流式細胞術是檢測細胞凋亡的有力工具,具有分析精確、重復性好、費用低廉、分析速度快等優點,再者具有檢測的細胞數量大、可定量分析群體細胞的凋亡以及可同時進行其他相關分析的特點。應用流式細胞術檢測凋亡細胞的方法主要包括以下三個方面:形態學的檢測、DNA含量分析、DNA降解分析(斷裂點標記法)。(2)形態學的檢測流式細胞術形態學檢測的兩個基本參數6:前向散射(PSC)反映細胞大小,側向散射(SSC)與細胞內粒子性質有關,反映細胞的均質性。凋亡細胞一般都出現細胞膜皺縮,核解聚,凋亡小體形成,胞漿濃縮,體積減小等形態學上的特征,經過流式細胞儀的前向角散射(forwardscatter,FSC)和側向散角射(sidescatter,SSC)分析后,即可區分出凋亡細胞和正常細胞,凋亡細胞的典型特征是前向角散射下降。由于細胞凋亡或壞死均有細胞內碎片增多,故SSC均高于正常。(3)DNA含量分析1)單參數分析PI一步染色法:收集細胞,PBS洗滌2次,冰凍70%乙醇固定,碘化丙啶(PI)染色,流式細胞儀檢測細胞DNA含量。細胞經低滲緩沖液或乙醇、TritionX-100處理后通透性增強,胞膜上會出現小的漏洞,由于細胞凋亡后DNA斷裂,在洗滌和染色過程中小片斷DNA會從細胞內漏出,使細胞DNA含量低于正常的二倍體含量。用染色后分析,會在二倍體峰前出現一個亞二倍體峰,即AP峰(apoptosispeak),可根據此峰的高低或面積計算凋亡細胞的百分率。2)雙參數分析通常用Hoechs-PI雙染法:正常細胞對其有拒染性,熒光著色淺,凋亡細胞主要攝取Hoechs-PI染料,呈強藍色熒光,而壞死細胞主要攝取Pl而呈紅色熒光,這樣就可以根據熒光強度區分正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞。DNA含量分析法快速、準確,簡單易行,所需樣本少,可大批量定量檢測凋亡標本。另外,還可同時進行細胞表面標志檢測以明確發生凋亡的細胞種類。缺點:(1)敏感性不高,首先凋亡早期雖然有DNA裂點出現,但尚未出現DNA片斷的大量丟失,因此該法不能檢測出早期凋亡;其次,發生于S期或G2M期的凋亡細胞即使有DNA片斷的丟失,也不低于二倍體細胞的DNA含量。(2)特異性不強,一部分壞死細胞碎片可呈現低熒光,位于二倍體峰前,可導致誤檢。(4)DNA降解分析(斷裂點標記法)細胞凋亡的最后階段是形成DNA片段,DNA斷裂點法檢測的即是DNA的斷裂片段,即標記DNA斷裂的3’-羥基末端,常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口轉移(ISNT)或用TdT介導的dUTP原位缺口末端標記TUNEL技術。標記后再進行上機檢測。特異性敏感性均比單獨使用某種技術有所提高。2.4流式細胞術檢測細胞凋亡TUNEL法是利用末端轉移酶TdT將標記的脫氧核苷酸轉移到DNA缺口或3’羥基末端上,通常使用的核苷酸為dUTP,標記物為地戈辛生物素、熒光素等,標記后的樣品與相應的酶聯抗體作用后,可催化底物產生顏色反應在普通顯微鏡下觀察。樣品被熒光素標記可直接在熒光顯微鏡下觀察或激光共聚焦顯微鏡下觀察或采用流式細胞儀檢測。后續有研究對其加以改進,采用不同的修復方法與修復液,結果經改進后TUNEL法能特異顯示凋亡細胞核為棕黃色,陰性對照片無棕色反應,正常細胞或繁殖細胞核為藍色。操作方法:取材,可以制備成石蠟切片、冰凍切片、細胞懸液等,繼而根據所購買的試劑盒按上面的說明操作。TUNEL法檢測10、11、12細胞凋亡最為敏感、特異的方法,可量化凋亡細胞,動態觀察凋亡細胞超微結構的變化以及與細胞表型同時分析。其局限性為只能標記中期及晚期凋亡細胞,不能檢測只發生DNA大片段(300bp以上)斷裂的凋亡細胞,也不能檢測斷裂末斷的準確數量,因為每個裂斷末端結合的標記分子的數量可因不同反應動力學而不同。3細胞凋亡檢測方法的選擇通過對上述4種檢測細胞凋亡方法的比較研究發現,目前實驗室尚無一種完美的檢測細胞凋亡的手段。眾多的研究方法各具特色,也都有一定的局限性,所以在研究細胞凋亡時,需結合既特異、靈敏,又能定量的多種手段來檢測。對于細胞凋亡的研究,采用幾種方法的聯合檢測,可以為檢測凋亡提供更加全面、準確、客觀的實驗依據,將具有重要的意義。更重要的是,充分了解各種方法的原理和特點,才能對檢測結果做出合理的判斷和分析。2.2dna凝膠電泳在上世紀80年代DNA凝膠電泳一度被認為是判定細胞凋亡的金標準之一。凋亡細胞的生化改變關鍵是DNA鏈被依賴的Mg、Ca離子激活內切核酸酶從核小體間切斷,形成大約(180~200)bp的DNA片段(寡聚核小體)或它的倍數