大鼠糖尿病膀胱病模型的建立

糖尿病性神經(jīng)源性膀胱（dnb）也稱為糖尿病性膀胱功能障礙（dnb）。糖尿病樣膽（cdp）顯示糖尿病引起的周圍神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢神經(jīng)末梢功能障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重的尿潴留、尿失禁和慢性腎功能衰竭。嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作。80%的糖尿病患者可并發(fā)此癥,即使經(jīng)治療控制了高血糖癥,仍有25%的患者存在DNB。目前DNB的發(fā)病機制研究是熱點,多數(shù)集中在動物研究上面,所以,復(fù)制一種穩(wěn)定可行的糖尿病膀胱病模型對于研究糖尿病神經(jīng)源性膀胱發(fā)病機制尤為重要。目前最常見的是采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)復(fù)制大鼠糖尿病模型,但應(yīng)用STZ復(fù)制穩(wěn)定的大鼠糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型的報道較少,為此,筆者一次性腹腔注射大劑量STZ誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型,現(xiàn)報道如下。1材料和方法1.1許可證號:scxk-stz實驗動物為清潔級SD大鼠,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2008-0002;STZ(美國Sigma公司);檸檬酸、檸檬酸鈉、羅氏卓越型血糖儀及血糖試紙、尿動力儀及微量灌注泵(美國Laborie公司)。1.2動物分組及分組實驗動物適用性喂養(yǎng)1周后,將55只SD大鼠(雌雄不拘,體質(zhì)量200~250g)隨即分為實驗組和對照組,實驗組45只,對照組10只,實驗組動物再分為A、B、C3組,每組各15只?？崭?2h后,檢測尾靜脈空腹血糖,A、B、C組分別一次性左腹腔注射50、60和70mg/kg的STZ(用pH=4.2的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液1︰1配制成10mg/mL的溶液),對照組動物注射等量的pH=4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,單籠單只喂養(yǎng),保證足夠攝食和飲水,動物房每日燈光照射12h,濕度40%~70%,溫度20~25℃。1.3陰道織物上的壓力-容積關(guān)系(1)觀察動物的攝食、飲水、尿量、精神狀態(tài)、皮毛光澤度,在0、2、4、6和8周分別記錄實驗組A、B、C組和對照組動物的體質(zhì)量變化及尾靜脈空腹血糖情況。(2)8周后檢測對照組和空腹血糖≥16.9mol/L的實驗各組大鼠的尿流動力學(xué):各組大鼠用戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉,以硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱,導(dǎo)管經(jīng)三通管與尿動力儀及微量灌注泵相連,輕壓腹部,排空膀胱尿液,用生理鹽水以0.2mL/min的速度灌注膀胱。根據(jù)膀胱充盈過程中壓力-容積關(guān)系,大鼠膀胱充盈分為壓力升高緩慢的低壓充盈期和壓力升高較快的高壓充盈期。參照大鼠不穩(wěn)定膀胱(DI)的判斷標(biāo)準(zhǔn),在膀胱低壓充盈期出現(xiàn)膀胱內(nèi)壓升高超過15cmH2O(1cmH2O=0.988kPa)的逼尿肌收縮時即為不穩(wěn)定膀胱。(3)檢測完尿流動力學(xué)后,取完整膀胱,10%甲醛固定,浸蠟,包埋切片,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察逼尿肌纖維排列、肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)等。(4)造模成功定義:8周后空腹血糖≥16.9mol/L且尿流動力學(xué)檢查為逼尿肌收縮功能減弱,殘余尿增多,最大膀胱容量增大,膀胱病理切片顯示逼尿肌纖維排列紊亂,肌細(xì)胞肥大。1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,進行方差分析、t檢驗以及χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1tz前后糖尿病并發(fā)癥的變化對照組大鼠正常飲食,體質(zhì)量增加,血糖無明顯波動;實驗組大鼠注射STZ后3d,開始出現(xiàn)煩渴多飲、多食、多尿的典型糖尿病癥狀,4周時皮毛變得暗淡無光澤,6周時精神萎靡、皮毛稀疏;8周時體質(zhì)量明顯減輕,尾靜脈空腹血糖明顯升高,均≥16.9mol/L。各組血糖見表1。2.2結(jié)果的尿流動力學(xué)與對照組比較,實驗各組大鼠最大膀胱容量增大,最大膀胱內(nèi)壓降低,殘余尿增多,膀胱順應(yīng)性增高。見表2及圖1。2.3尿肌纖維排列形態(tài)對照組膀胱病理切片常規(guī)HE染色(見圖2A)示膀胱逼尿肌纖維排列規(guī)整,肌細(xì)胞大小及形態(tài)正常,而實驗A組(見圖2B)、B組(見圖2C)、C組(見圖2D)膀胱逼尿肌纖維排列紊亂,肌細(xì)胞肥大,形態(tài)各不相同。2.4成膜率及存活率測定實驗A組(低劑量)存活率高,但成膜率偏低;實驗C組(高劑量)成膜率及存活率均較低;而實驗B組(中間劑量)成膜率及存活率均較高。見表3。3關(guān)于自發(fā)緩解的問題STZ是一種對胰腺β細(xì)胞起選擇性破壞作用的藥物,一次性腹腔注射大量STZ將在短期內(nèi)引起胰腺β細(xì)胞大量壞死,導(dǎo)致動物出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦等典型的1型糖尿病癥狀。本實驗組大鼠一次性腹腔注射了大劑量的STZ后,除了出現(xiàn)上述典型的1型糖尿病癥狀外,皮毛干枯無光澤,腹型肥胖,肢體末端潰瘍甚至壞疽,后期皮毛脫落變得稀疏,部分大鼠尿液及糞便呈異常酸臭味,甚至出現(xiàn)酮癥酸中毒而死亡。注射不同劑量的STZ對誘導(dǎo)1型糖尿病模型的成功率及穩(wěn)定性影響很大。通過實驗發(fā)現(xiàn),注射STZ劑量過低,1型糖尿病模型的成模率低,但存活率高,大鼠對高血糖的耐受性良好;若注射STZ劑量過高,大鼠對高血糖的耐受性差而導(dǎo)致死亡率較高,且1型糖尿病模型的成模率低;而注射中間劑量的STZ(60mg/kg)大鼠的耐受性好,1型糖尿病模型成模率及存活率均較高,成模穩(wěn)定,因此認(rèn)為一次性腹腔注射60mg/kg的STZ,SD大鼠的1型糖尿病模型的成模最穩(wěn)定。實驗過程中發(fā)現(xiàn)少數(shù)大鼠在注射STZ后空腹尾靜脈血糖升高一段時間后(均發(fā)生在注射STZ3周內(nèi))恢復(fù)正?；蚪咏?這種自發(fā)緩解的現(xiàn)象原因未明,可能與胰腺濾泡細(xì)胞增殖分化為胰腺β細(xì)胞有關(guān)。國內(nèi)對有關(guān)自發(fā)緩解的研究少有報道,有學(xué)者將第5周以前自發(fā)緩解的SD大鼠的血糖水平和正常組大鼠的血糖水平進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。國外學(xué)者則從病例生理結(jié)構(gòu)變化,甚至基因表達水平改變,來研究動物這種自發(fā)緩解的可能原因,并取得一些創(chuàng)新科研成果。目前大鼠膀胱測壓方法分為腹腔麻醉下經(jīng)尿道膀胱置管膀胱測壓和清醒狀態(tài)下經(jīng)恥骨上膀胱造瘺置管測壓2種方法,前者操作簡單、快速,易于控制,且麻醉狀態(tài)下測得的尿動力學(xué)指標(biāo)相對穩(wěn)定,可配合藥物治療或手術(shù)治療等干預(yù)措施,但麻醉藥物可抑制大鼠排尿反射,經(jīng)尿道置管增加了尿道內(nèi)排尿阻力,與生理狀態(tài)下排尿不同;后者在清醒狀態(tài)下測得的各項尿動力學(xué)指標(biāo)更接近于生理狀態(tài),重復(fù)測壓方便,可對一些干預(yù)因素進行動態(tài)觀察,但在清醒狀態(tài)下測壓受干擾因素較多,且對于手術(shù)治療等干預(yù)措施影響較大。筆者在實驗中應(yīng)用了戊巴比妥鈉腹腔麻醉,經(jīng)尿道將硬膜外導(dǎo)管置入膀胱測壓。腹腔注射STZ約8周后,通過檢測膀胱尿流動力學(xué)發(fā)現(xiàn),大鼠出現(xiàn)膀胱容量增大,膀胱內(nèi)壓降低,順應(yīng)性增高,殘余尿量增多;尿流動力學(xué)圖顯示排尿過程中腹內(nèi)壓與膀胱內(nèi)壓變化一致,膀胱逼尿肌的收縮壓較弱,提示膀胱充盈后,主要依靠腹內(nèi)壓排尿,反映了膀胱逼尿肌收縮無力,這些是由逼尿肌收縮功能減退導(dǎo)致的,與王東文等在臨床上研究糖尿病神經(jīng)源性膀胱患者的尿動力學(xué)結(jié)果相一致。糖尿病神經(jīng)源性膀胱患者出現(xiàn)膀胱感覺功能減退,但在活體大鼠體內(nèi)無法檢測膀胱感覺功能,只能從尿流動力學(xué)圖上大體觀察出膀胱逼尿肌收縮功能減弱,王東文等進行了發(fā)病6周的糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱肌條機械牽張刺激實驗,發(fā)現(xiàn)逼尿肌肌條的興奮性降低,張力閾值增高;興奮性的改變進一步導(dǎo)致平均收縮力和最大收縮力下降,影響到膀胱排出尿液的壓力和流速。光鏡下逼尿肌的正常結(jié)構(gòu)由平滑肌細(xì)胞及其細(xì)胞間質(zhì)、神經(jīng)纖維組成,上述任何結(jié)構(gòu)發(fā)生病變將影響逼尿肌收縮功能。目前研究認(rèn)為糖尿病大鼠神經(jīng)源性膀胱光鏡下逼尿肌的病理改變主要為肌束增粗、肌束間隙增寬、肌纖維排列紊亂、肌束間膠原含量減少。對照組大鼠膀胱內(nèi)無殘余尿,膀胱壁張力好,實驗組大鼠膀胱較大,但膀胱壁彈力差。病理切片顯示膀胱壁增厚,逼尿肌纖維排列紊亂,肌細(xì)胞肥大腫脹,形態(tài)多樣,細(xì)胞功能受損嚴(yán)重。這種由于長期容量增加導(dǎo)致的膀胱逼尿肌代償性肥大,在形態(tài)學(xué)上提示逼尿肌已明顯受損,與尿流動力學(xué)提示的逼尿肌收縮功能受損結(jié)果相符合,從而在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方