雞艾美耳球蟲菌種的分離鑒定

到目前為止，家蠶有7種艾美耳球蟲，它們在卵囊的形狀、結構、大小、腸球菌病、寄生蟲部位、最短的菌化時間和最短的潛伏期方面具有各自的特點。這使球蟲診斷問題復雜化。近年來,分子生物學和基因診斷學在理論和技術上的發展,為蟲種鑒定和病原學診斷提供了有用的工具,本試驗利用單卵囊分離技術得到艾美耳球蟲純種卵囊4株,常規鑒定為堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲。經增殖純化后,提取其基因組DNA,用特異性引物進行PCR擴增進一步證實該蟲種是否為純種,為進一步研究堆型艾美耳球蟲建立其噬菌體抗體庫奠定堅實的基礎。1材料和方法1.1下籠養至15日齡購于保定大午有限公司1日齡雛雞,在無球蟲環境下籠養至15日齡用于試驗。試驗蟲種,取自保定市某雞場死于球蟲病的雞腸道內容物中,按常規方法分離出球蟲卵囊,培養至孢子化,為混合卵囊。1.2pcr試劑與dl-2.1購于天根生化科技(北京)有限公司,DL-2000,DL-3000購于保定市海賽克生物技術有限公司,PCR試劑為寶生物工程(大連)有限公司產品。1.3不同卵囊的接種取分離的混合卵囊,加適量自來水離心(3000r/min離心10min)。棄掉上清后再加自來水進行第2次離心,反復3次直至上液澄清。在試管中將離心的卵囊液用生理鹽水進行倍比稀釋,并不斷在顯微鏡下觀察,使稀釋的卵囊液濃度每滴中含有一個或兩個卵囊。參照Remmber等的方法,取1%瓊脂糖加熱溶解,澆在載玻片上,凝固后用小刀切割成0.3～0.4cm2的小塊,置另一潔凈玻片上,上方鋪一同樣大小的保鮮薄膜。用尖頭吸管吸取已稀釋好的卵囊液,輕輕點在瓊脂薄膜上,先在10×10倍光學顯微鏡下找準位置,再用10×40倍觀察。確保整個視野內只有單個卵囊時,用滅菌鑷子夾住瓊脂薄膜一角,輕輕送入15日齡的雛雞口中,若非孢子化卵囊均棄之不用,完成單卵囊的接種。接種的雛雞自60h開始,每2d檢測1次糞便,以確定是否感染。對感染的雛雞,用飽和鹽水漂浮法收集糞便中的卵囊,經完全孢子化后,于2.5%(W/V)重鉻酸鉀液中4℃保存備用。1.4純繁殖單卵囊繁殖的后代卵囊孢子化后,再接種無球蟲感染的雛雞,進行卵囊增殖。1.5雞的臨床指標評價純種卵囊增殖后,以每只雞10萬個孢子化卵囊分別經口感染2周齡無球蟲感染雛雞30只,按雞的臨床癥狀、潛伏期、最短孢子化時間以及卵囊的形狀指數、結構等一系列指標,參考國內外文獻,確定其種。1.6通過沉淀去原代地,加入不同的水氣流液和內滲透液用清水洗去收集的孢子化卵囊溶液中的重鉻酸鉀,依次用200目、300目和400目銅篩過濾,濾液經3000r/min離心15min,去掉上清液,在沉淀中加入飽和鹽水1500r/min離心10min,離心管上層飄浮的乳白色似“塞子”狀的物質即卵囊。將其移入新管中,用10倍的蒸餾水稀釋,3000r/min離心15min收集沉淀,然后于沉淀中加入20%次氯酸鈉,在4℃下作用20min,最后用滅菌的蒸餾水離心洗滌3次,除去小的雜質和次氯酸鈉,即可得到純化的孢子化卵囊。1.7球卵囊裂解觀察將純化好的卵囊3000r/min離心10min,棄掉大部分上清后,用超聲波細胞粉碎儀對球蟲卵囊進行裂解(150w,8s/次,8次),至顯微鏡觀察有95%卵囊壁破碎后,10000r/min離心1min,棄上清。將得到的沉淀按基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA,于-20℃保存備用。1.8pcr擴增及鑒定根據S.Fernandez等(2003)報道,堆型艾美耳球蟲特異性引物為:上游:5′-AGTCAGCCACACAATAATGGCAAACATG-3′下游:5′-AGTCAGCCACAGCGAAAGACGTATGTG-3′擴增體系為:10×PCRBuffer(Mg2+free)2.5μL,MgCl2(25μmol)3.5μL,dNTPmixture(2.5umoleach)2μL,引物(50pmol/μL)0.35μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板DNA1μL,滅菌ddH2O15.15μL,總體積為25μL。反應條件為:96℃預變性5min,接著進入循環,94℃變性1min,62.9℃退火2min,72℃延伸2min,共30個循環,最后72℃延伸7min。取5μLPCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,再經紫外凝膠成像系統觀察并記錄結果。柔嫩艾美耳球蟲特異性引物為:上游:5′-CC-GCCCAAACCAGGTGTCACG-3′;下游:5′-CCG-CCCAAACATGCAAGATGGC-3′擴增體系為:10×PCRBuffer(Mg2+free)2.5μL,MgCl2(25umol)2.5μL,dNTPmixture(2.5umoleach)2μL,引物(50pmol/μL)0.25μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板DNA1μL,加滅菌ddH2O至25μL。反應條件為:96℃預變性5min,接著進入循環,94℃變性1min,65℃退火2min,72℃延伸2min,共30個循環,最后72℃延伸7min。取5μLPCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,再經紫外凝膠成像系統觀察并記錄結果。2結果2.1單囊卵巢保存分析分離的單卵囊經口接種20只雛雞,有4只雛雞感染,感染率為20%。2.2球卵囊的分離將4株單卵囊繁殖的后代接種無球蟲感染雛雞,結果如表1。由此可以初步確定,單卵囊分離得到的4株球蟲卵囊中,第1、2株為堆型艾美耳球蟲卵囊;第3、4株為柔嫩艾美耳球蟲卵囊。2.3卵囊純球蟲卵囊經純化后,在顯微鏡下可見清晰的孢子化卵囊。2.4dna提取用紫外分光光度計測定每株球蟲卵囊所提取的DNA,D260/D280值依次為1.88,1.90,1.85,1.90,這說明所提取的基因組DNA內無蛋白和RNA存在,DNA濃度約為20μg/mL,符合分子生物學試驗的要求。雞球蟲的基因組龐大,如柔嫩艾美耳球蟲至少有14條染色體,且大多數染色體的大小在3.5×106～5.0×106bp,基因組DNA約為5.5×107～6.0×107bp。2.5株卵囊的目的條帶用特異性引物分別擴增4株(兩種)卵囊的基因組DNA,結果顯示前2株卵囊均擴增出了清晰的目的條帶,約810bp左右,符合預期的大小;后兩株卵囊也擴增出清晰的目的條帶,約530bp左右。進一步證實4株蟲種分別是純種的堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲(圖1,圖2)。3最佳反應體系的篩選3.1基于PCR技術的分子分類法具有簡便、快速、信息量豐富等優點,不僅可以對種、株進行鑒定,而且可以區分形態相近的近緣種,尤其是可以探索其親緣關系。但是,由于存在污染、不適宜反應條件等影響PCR反應的靈敏度和特異性,因此,利用PCR建立的診斷體系在用于臨床檢測之前,要對各個影響因素進行優化,篩選出最佳反應體系,從而提升PCR診斷的靈敏度和特異性。3.2在提取卵囊基因組DNA時,由于球蟲卵囊的結構十分復雜,加入細胞裂解液后,要在56℃水浴鍋中過夜消化充分溶解蛋白,然后再按照試劑盒說明書進行下一步,以更好的提取出基因組DNA。3.3本次