鉤藤對癲癇模型海馬腦片誘發場電位的影響

鉤藤具有平肝健風、清肝瀉的功效。其主要成分是蚓跺類生物堿。鉤膝與牛膝配伍,可有明顯的抗戊四唑驚厥的作用,單味鉤藤對小鼠自主活動有明顯抑制作用。天麻鉤藤飲對小鼠有催眠作用。中醫臨床上用來主治肝風內動、驚癇抽搐。現代醫學認為癲癇發作的電生理本質是神經元過度同步放電的結果。本研究以離體海馬腦片CA1區錐體細胞誘發群鋒電位PS的幅度為指標,觀察鉤藤對毛果蕓香堿致癇大鼠海馬腦片誘發場電位的影響,探討鉤藤對中樞神經系統的作用,為中藥治療癲癇提供理論依據。1材料和方法1.1藥物、針劑、相對生物實驗對象為Wistar大鼠,體重120～150g,雌雄不限。由天津市勞動衛生研究所實驗動物研究中心提供。鹽酸毛果蕓香堿(Pilocarpine.HCL,德國GMBH公司生產。由天津市化學試劑公司提供)。純品加蒸餾水配制成100mg/ml濃度溶液。鉤藤提取液由天津市南開醫院中西醫結合研究所制劑室采用醇浸方法提取并制成1∶1(1g/ml)注射針劑(1g生藥制成1ml提取液)。人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)成分(mmol.L-1):NaCl124,NaHCO326,KH2PO41.2,MgCl2.6H2O2.4,KCl3.3,CaCl22.5,C6H12O6.H2O10。pH值為7.35。1.2制備癲癇模型Wistar大鼠,腹腔注射鹽酸毛果蕓香堿(350mg/kgb.w)制備癲癇模型。選取出現癲癇大發作的大鼠20只,飼養一周后進行實驗。1.3腦片的制備和人工誘導致癇后7d,將大鼠隨機分為對照組和實驗組,每組10只。將大鼠在清醒狀態下斷頭,迅速取全腦置于4℃的人工腦脊液中持續給予95%O2和15%CO2飽和,待腦組織冷卻后迅速剝離出海馬,沿海馬槽纖維平行方向將海馬人工切成350～400μm厚的腦片,并將腦片移至預先通以95%O2和5%CO2混合氣的室溫的ACSF中(pH為7.35),室溫下孵育1～2h。1.4刺激電極誘發腦片電位將孵育后腦片移至以上述人工腦脊液灌流的內浴槽,灌流速率為1.25ml/min。保持溫度35℃。用微操縱器將充滿生理鹽水的玻璃微電極(即記錄電極)插入海馬CA1區錐體細胞層,以引導誘發的場電位。刺激電極則置于CA3區發出的Schaffer側支處。刺激參數為0.1ms和1Hz。由刺激電極誘發的場電位經記錄電極引導,經微電極放大器放大,輸入SBR-1型雙線示波器,經好友生物信號分析系統(由天津醫科大學研制)轉換至電子計算機進行觀察、記錄、測量、分析。實驗時選取能記錄出誘發場電位的腦片進行實驗,首先記錄給藥前的誘發場電位,待其穩定30min后再進行藥物實驗。給藥后連續觀察20～30min,記錄誘發場電位幅度變化和恢復時間。給藥途徑選用腦片旁微量滴注法,滴注量為20μl(分四滴,每滴5μl)。本實驗以滴加生理鹽水為對照組,觀察鉤藤提取液對致癇大鼠CA1區PS的影響。1.5處理數據實驗結果用均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,配對t檢驗,利用SPSS統計軟件進行統計學處理。2結果2.1滴注鹽水前后在10例致癇海馬腦片的誘發場電位的記錄中,滴注生理鹽水前后,其幅度無明顯變化(P>0.05)。這說明,腦片表面微量滴注生理鹽水后,對誘發場電位無明顯影響(圖1)。2.2鉤藤對致癇海馬腦片誘發場電位的影響本實驗觀察了14例致癇海馬腦片在滴加鉤藤提取液前、后其誘發場電位的變化。實驗結果顯示1g/ml濃度的鉤藤使致癇海馬腦片誘發場電位幅度明顯下降,幅度平均降低27.64%,平均8.71min恢復,經統計學檢驗,P<0.01,有顯著意義(圖2,表1)。3胞內鈣通道及鉤藤堿在癲癇中的作用本研究顯示鉤藤對中樞神經系統的突觸傳遞過程有明顯的抑制效應,具有抗癲癇作用。海馬CA1區錐體神經元有著眾所周知的Na+電導、K+電導以及Ca2+再生性電導。海馬CA3區錐體細胞在去極化過程中不僅產生對TTX敏感的Na+-依賴性波峰還產生高閾值的TTX不敏感的鈣依賴性波峰。在CA3區錐體細胞的Schaffer側支與CA1區錐體細胞之間的突觸為興奮性突觸,以谷氨酸為遞質。當谷氨酸與其海人酸(KA)受體、使君子酸(QA)受體結合時,激活Na+通道,使細胞膜去極化,當膜電位達到電壓依賴性鈣通道(VDCC)激活的閾電位時,VDCC開放,細胞外鈣內流。谷氨酸與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結合后,受體門控通道(ROCC)激活,Ca2+內流。環磷酸腺苷(cAMP)依賴的蛋白激酶能調節VDCC和ROCC,cAMP在增加鈣通道的Ca2+內流中起重要作用。胞內鈣濃度和胞膜鈣流的增加在癲癇發生上起重要作用。在青霉素局灶癲癇動物模型的大腦皮層中,觀察細胞外鈣變化與癇性發作之間的關系,發現細胞外鈣下降與癇性發放相關,濃度下降始于癇性發放前,提示鈣過量內流在癇性活動中的起始作用。鉤藤的主要成分鉤藤堿能阻滯外Ca+內流和內Ca2+釋放。鉤藤堿對大鼠大腦皮層神經元L-型鈣通道有阻滯作用。鉤藤堿和異鉤藤堿對電位依賴性鈣通道具有阻滯作用。近年來,一氧化氮(nitricoxide,NO)在癲癇中的作用日益受到重視。一系列的實驗均有力證明,NO可能致癇。有人推測,NO可能作為一個逆行信使作用于突觸前膜,通過cGMP而促進Ca2+內流,細胞內的Ca2+升高既促使細胞去極化產生異常放電而導致癲癇的發生和傳播,又可增加谷氨酸的釋放而加劇發作。鉤藤堿對大鼠腦缺血-再灌注皮層和海馬一氧化氮合酶(NOS)變化的作用研究顯示,鉤藤堿可抑制NOS陽性細胞數目