毛果一枝黃花化學成分及抗炎活性研究

科可可分為120多種植物，在中國有四種。這是一棵具有約束力的黃浦。加拿大的一級植物s.慈姑和鈍苞。目前一枝黃花屬植物國內研究較少,國外研究相對較多,但要充分利用其生物多樣性,便于更好地應用于臨床,還需不斷深入的研究。本課題組已經對我國存在的3種一枝黃花屬植物一枝黃花、加拿大一枝黃花和鈍苞一枝黃花的化學成分和藥理活性進行了系統的研究,為完善該屬植物的化學成分及藥理學研究,本實驗對毛果一枝黃花的化學成分進行了研究。毛果一枝黃花SolidagovirgaureaL.又名新疆一枝黃花,為菊科一枝黃花屬植物毛果一枝黃花的干燥全草,多年生草本植物,主產于我國新疆阿爾泰山等海拔較高地區的樹林下及灌木叢中,在我國東北、華北地區以及前蘇聯、蒙古也有分布。毛果一枝黃花作為藥用植物,全草入藥,對腎炎及膀胱炎有效,其主要化學成分主要有二萜、黃酮、皂苷、苯丙酸及苯甲酸芐酯類化合物等,具有抗菌消炎、利尿、抗腫瘤等作用。本實驗從毛果一枝黃花干燥全草中分離得到9個化合物,分別鑒定為2′-甲氧基苯甲醇-2-甲氧基-6-羥基苯甲酸酯(2′-methoxybenzyl-2-methoxy-6-hydroxybenzoate,1)、2′-甲氧基苯甲醇-2,6-二甲氧基苯甲酸酯(2′-methoxybenzyl-2,6-dimethoxybenzoate,2)、毛果一枝黃花素(solidagobenzofuran,3)、十六烷酸(hexadecanoicacid,4)、水楊酸(salicylicacid,5)、對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoicacid,6)、毛果一枝黃花糖苷(solidagovirgaureaglycoside,7)、山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-β-D-rutinoside,8)、蘆丁(rutin,9)。其中,化合物3和7為新化合物?？寡谆钚匝芯勘砻?化合物1和2對脂多糖(LPS)誘導的小鼠單核細胞RAW264.7釋放的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-6(IL-6)具有抑制作用,而化合物7無明顯抑制作用。1儀器、試劑和儀器AgilentTrapVL型質譜儀(HPAgilent),Agilent1100型LC-MS液質聯用儀,BrukerAvance600型核磁共振儀(瑞士Bruker公司),INOVA—600型核磁共振儀(美國Varian公司),X—6型顯微熔點測定儀(北京亞歐德鵬公司)。聚酰胺30~60目(國藥集團),柱色譜用硅膠(200~300、300~400目)、薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠),ODSC18反相色譜柱,SephadexLH-20(GEHealthcareBio-SciencesAB),大孔樹脂D-101(山東魯抗樹脂分廠)。毛果一枝黃花全草于2010年8月購自安徽省亳州市華申藥業有限公司,經山東省醫學科學院藥物研究所唐文照博士鑒定為毛果一枝黃花SolidagovirgaureaL.的干燥全草。2化合物結構鑒定毛果一枝黃花干燥全草20kg,用95%乙醇冷浸提取3次,每次冷浸7d,減壓回收并濃縮,得浸膏約1kg。浸膏加水混懸后,依次用氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取,濃縮,得到3個不同極性部位。氯仿部位經聚酰胺柱色譜,流動相為水-乙醇(100∶0→0∶100),得到A、B兩個部分,A部分經硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇100∶0→0∶100)和重結晶得到化合物1(150mg)、2(10mg)、3(7mg);B部分經硅膠柱色譜(石油醚-丙酮100∶0→0∶100)得到化合物4(20mg)。對醋酸乙酯部位進行硅膠柱色譜(二氯甲烷-醇100∶0→50∶50),并通過凝膠SephadexLH-20反相、ODS柱色譜得到化合物5(7mg)、6(30mg)。對正丁醇部位經D101型大孔樹脂洗脫后進行硅膠柱色譜(二氯甲烷-醇99∶1→0∶100),并通過凝膠SephadexLH-20反相、ODS柱色譜得到化合物7(25mg)、8(21mg)、9(18mg)。部分化合物結構見圖1。3鑒定化合物為2-甲氧基苯甲醇-2,6-二甲氧基苯甲酸酯,2,3-och3--3-5-3-5-3-5-3-5-3-5-3-5-3-5-3-甲基苯甲酸酯,3.2.3,4.2,3-5-3-甲基苯甲酸酯,3.4,5.2,3.4,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,5.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4.3,4-3,5.3,4-化合物1:無色結晶(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:289[M+H]+,311[M+Na]+,相對分子質量為288。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:3.90(6H,s,2,2′-OCH3),5.49(2H,s,-CH2-),6.46(1H,d,J=8.4Hz,H-5),6.62(1H,d,J=8.4Hz,H-3),6.93(1H,d,J=8.4Hz,H-3′),7.01(1H,t,J=7.6Hz,H-5′),7.35(1H,td,J=8.4,1.8Hz,H-4′),7.36(1H,t,J=8.4Hz,H-4),7.56(1H,d,J=7.6Hz,H-6′);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:56.1(2-OCH3),55.3(2′-OCH3),124.2(C-1),163.3(C-2),103.7(C-3),135.0(C-4),102.5(C-5),161.1(C-6),170.3(C-7),62.8(C-8),110.1(C-1′),156.9(C-2′),110.2(C-3′),128.5(C-4′),120.5(C-5′),129.2(C-6′)。以上數據與文獻報道一致,故鑒定化合物1為2′-甲氧基苯甲醇-2-甲氧基-6-羥基苯甲酸酯。化合物2:無色結晶(二氯甲烷),mp100℃。ESI-MSm/z:303[M+H]+,325[M+Na]+,相對分子質量為302。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:3.83(6H,s,2,6-OCH3),3.87(3H,s,2′-OCH3),5.47(2H,s,-CH2-),6.57(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),6.90(1H,d,J=7.8Hz,H-3′),6.97(1H,t,J=7.8Hz,H-5′),7.29(1H,t,J=8.4Hz,H-4),7.31(1H,t,J=7.8Hz,H-4′),7.50(1H,d,J=7.8Hz,H-6′);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:56.2(2,6-OCH3),55.6(2′-OCH3),124.8(C-1),158.8(C-2),104.3(C-3),131.4(C-4),104.2(C-5),157.7(C-6),166.8(C-7),62.5(C-8),113.5(C-1′),157.5(C-2′),110.5(C-3′),129.4(C-4′),120.6(C-5′),129.5(C-6′)。以上數據與文獻報道一致,故鑒定化合物2為2′-甲氧基苯甲醇-2,6-二甲氧基苯甲酸酯?；衔?:淡黃色粉末(二氯甲烷-丙酮),ESI-MSm/z:465[M+H]+,487[M+Na]+,463[M-H]-。1H-NMR(600MHz,CD3COCD3)δ:2.39~2.41(2H,m,-CH2-),2.40(3H,s,-CH3),4.17~4.19(2H,m,-CH2-),6.61(1H,s,H-3),6.80(1H,s,H-4),7.64(1H,s,H-7),12.06(1H,s,-OH);13C-NMR(150MHz,CD3COCD3)δ:24.1(C-13),26.7(C-11),51.8(C-12),63.9(C-14),104.1(C-3),106.5(C-4),111.9(C-7),115.4(C-6),136.7(C-9),147.6(C-8),158.0(C-5),166.8(C-2),204.4(C=O)。氫譜和碳譜信號經HSQC和HMBC譜歸屬,結合質譜數據,表明該化合物為對稱結構。HMBC譜(圖2)顯示δH7.64(H-7)和C-5,8,9,10相關,δH6.80(H-4)和C-6,3相關,δH6.61(H-3)和C-8,9相關,δH2.59(-CH3)和C-6,10相關,推測存在苯駢呋喃母核結構,且連有乙?；＆腍4.20(-CH2-)和C-2,C-12(季碳)以及C-13相關,以及δH2.41與C-2,12,14相關,可基本驗證上述結構的正確性。因存在四元環,通常情況下該結構不穩定,故需單晶衍射驗證,單晶培養正在進行中。經Sciencefinder檢索,確定化合物3為新化合物,命名為毛果一枝黃花素?；衔?:白色結晶(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:255[M-H]-,相對分子質量為256,分子式為C16H32O2。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:0.89(3H,t,J=7.2Hz,-CH3),1.31(2H,m,-CH2CH3),2.36(2H,t,J=7.2Hz,-CH2COOH);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:14.1(-CH3),24.7(-CH2CH3),34.0(-CH2COOH),21.1~31.9(12×-CH2),180.0(-C=O-)。結合以上數據鑒定化合物4為十六烷酸。化合物5:無色針狀結晶(二氯甲烷),ESI-MSm/z:139[M+H]+,137[M-H]-,相對分子質量為138。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:6.97(1H,td,J=8.4,1.0Hz,H-4),7.04(1H,dd,J=8.4,1.0Hz,H-6),7.56(1H,td,J=8.4,1.0Hz,H-5),7.96(1H,dd,J=8.4,1.0Hz,H-3)。綜合以上光譜數據,鑒定化合物5為水楊酸化合物6:白色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:139[M+H]+,137[M-H]-,相對分子質量為138。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:6.70(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),7.88(2H,d,J=8.4Hz,H-2,6);13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:114.6(C-3,5),121.3(C-1),131.6(C-2,6),161.9(C-4),168.7(-COOH)。結合文獻報道,鑒定化合物6為對羥基苯甲酸?；衔?:白色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:637[M+Na]+,653[M+K]+,相對分子質量為614。1H-NMR(600MHz,CD3OD)中δ3.80(3H,s)提示存在-OCH3,δ4.81和4.99(1H,d,J=7.8Hz)為糖端基氫信號,δ5.54(2H,s)提示存在羥甲基,δ6.62(1H,d,J=9.0Hz,H-6),7.29(1H,d,J=9.0Hz,H-5)為四取代苯上鄰位氫信號,δ7.07(1H,t,J=7.5Hz,H-4′),7.25(1H,d,J=7.5Hz,H-3′),7.34(1H,t,J=7.5Hz,H-5′),7.51(1H,d,J=7.5Hz,H-6′),表明存在鄰二取代苯結構。13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:61.4(-CH2),62.4(-OCH3),61.0(Glc-C-6),61.1(Glc-C-6′),69.9(Glc-C-5),69.9(Glc-C-5′),73.5(Glc-C-4),73.6(Glc-C-4′),76.6(Glc-C-3),76.6(Glc-C-3′),76.7(Glc-C-2),76.7(Glc-C-2′),101.2(Glc-C-1),102.3(Glc-C-1′),111.2(C-6),113.2(C-1),115.2(C-3′),122.0(C-4′),122.9(C-5),125.2(C-1′),129.4(C-5′,6′),143.3(C-3),149.1(C-2),153.3(C-4),155.5(C-2′),167.8(-C=O)。其中δC62.4(-OCH3)的存在表明了苯環中甲氧基兩側均被取代,氫譜和碳譜信號經HSQC和HMBC譜歸屬,HSQC數據表明,δH6.62和δC111.3以及δH7.29和δC122.9分別直接相連為A苯環未被取代信號,δH7.07和δC121.7,δH7.25和δC115.2,δH7.34,7.51和δC129.4(C-5′,6′)分別直接相連,為B苯環中的未被取代的質子及其碳信號。HMBC(圖3)顯示δH3.87和δc149.1相關為與A苯環相連的甲氧基信號,δH4.79與δC143.3(C-3)相關信號為A苯環相連的葡萄糖信號,δH6.62與δC113.2(C-1),149.1(C-2),153.3(C-4)以及167.8(C=O)的碳信號相關,表明該氫信號與連糖碳信號(C-3)為對位,與C-1為鄰位,δH7.29與δc153.3(C-4),149.1(C-2),143.3(C-3),113.2(C-1)分別相關。綜上推斷出A環C-1~C-4號位所連基團分別為-COO-、-OCH3、-OGlc、-OH,結合文獻報道中平滑果一枝黃花糖苷(leiocarposide)的苷元和糖的光譜數據,與該化合物相似,故確定并命名該化合物為毛果一枝黃花糖苷。化合物8:黃色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:595[M+H]+,617[M+Na]+,593[M-H]-,相對分子質量為594。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:1.45(3H,d,J=6.0Hz,H-6′′′),4.65(1H,s,H-1′′′),5.50(1H,d,J=7.2Hz,H-1′),6.54(1H,d,J=1.5Hz,H-6),6.76(1H,d,J=1.5Hz,H-8),7.25(2H,d,J=9.0Hz,H-3′,5′),8.45(2H,d,J=9.0Hz,H-2′,6′),結合以上光譜數據,并將該化合物與山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷對照品共薄層,其Rf值及顯色行為均一致,故鑒定化合物8為山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷?；衔?:黃色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESI-MSm/z:611[M+H]+,609[M-H]-,相對分子質量為610。與蘆丁對照品共薄層,顯示其Rf值與顯色情況均相同,結合文獻報道,鑒定化合物9為蘆丁。長久以來,毛果一枝黃花作為一種抗菌消炎的藥用植物已得到廣泛應用,尤其對腎炎及膀胱炎療效顯著。苯甲酸芐酯類化合物是毛果一枝黃花植物中的主要成分之一,為了對該屬植物的抗炎活性的來源和機制進行更深入的研究,本實驗運用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),通過利用LPS誘導體外炎癥模型,檢測苯甲酸芐酯類化合物對LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7釋放炎癥介質IL-6和TNF-α的抑制作用,來探尋該類化合物的抗炎活性和機制。4.1材料和儀器4.1.1供試品苯甲酸芐酯類化合物:2′-甲氧基苯甲醇-2-甲氧基-6-羥基苯甲酸酯(1)、2′-甲氧基苯甲醇-2,6-二甲氧基苯甲酸酯(2)和毛果一枝黃花糖苷(7),為毛果一枝黃花中提取分離得到。4.1.2試劑DMEM培養基購自美國Gibgo公司;胎牛血清,批號120602,購自浙江天杭生物科技有限公司;胰蛋白酶、LPS購自美國Sigma公司;小鼠TNF-α和IL-6ELISA檢測試劑盒購自聯科生物技術有限公司。4.1.3儀器Forma3111水套式二氧化碳培養箱,美國Forma公司生產;1420Victor多標記檢測儀,美國PerkinElmer公司產品;XDS—IB倒置生物顯微鏡,重慶光學儀器廠產品;96孔培養板,美國BectonDickinson公司生產。4.1.4細胞株:小鼠單核細胞RAW264.7由山東大學藥學院饋贈。4.2培養條件確定采用ELISA法,進行化合物的活性研究。4.2.1供試品的配制準確稱取供試品各1mg,加20μLDMSO溶解,用含10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋至終濃度分別為1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L,備用。4.2.2ELISA法測定TNF-α和IL-6水平取指數生長期RAW264.7細胞,用含