玻璃化冷凍對卵母細胞形態及卵裂率的影響

母乳細胞超低溫冷凍保存是保護品種資源、挽救瀕危物種不可或缺的技術保證之一。它也是加快動物育種和胚胎移植技術產業化的重要組成部分。同時，它為現代生物技術的生產、反應和微針培養等提供了豐富而廉價的材料。通過對卵母細胞的冷凍保存,對探討其低溫生物學特性和體外受精機理的研究有著重要意義(李林鳳等,2006)。此外,在醫學上卵母細胞的冷凍保存將會為那些生殖障礙的病人提供一個生育的機會(Noyes等,2010)。卵母細胞的冷凍是借鑒胚胎的冷凍方法,但其效果水平還較低,目前,只有小鼠成熟卵母細胞的冷凍取得了較為理想的結果(Carroll等,1993)。牛、羊和豬等家畜冷凍卵母細胞的受精率、卵裂率和發育率相對較低,尤其是山羊卵母細胞的冷凍保存研究少且進展緩慢(孫琪等,2008;賈映輝等,2009)。本試驗在前人研究的基礎上,以冷凍環法冷凍云嶺山羊不同發育時期的卵母細胞,比較不同時期卵母細胞的發育能力,從而為云嶺山羊種質資源保存的研究奠定基礎。1材料和方法1.1外科手術剪切除卵巢表面核心組織的清理本試驗以屠宰場云嶺黑山羊卵巢卵母細胞為試驗材料。用切割法采集卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocytecomplexes,COCs)。將卵巢用含有50μg/mL硫酸慶大霉素的生理鹽水洗凈后,用外科手術剪剔除卵巢表面的多余組織,然后用生理鹽水洗凈,再用滅菌紗布擦干置于盛有抽卵液的培養皿中。在培養皿中用手術刀片切開卵巢表面2～5mm的卵泡,并用鑷子將卵泡液擠壓出來。切剖完成后,在體視顯微鏡下檢卵。根據試驗需要吸取形態完整,細胞質致密,色澤均一,卵丘細胞在3層或3層以上,且包裹致密的COCs用于體外培養。1.2醇酯類化合物hgm抽卵液:PBS+36mg/L丙酮酸鈉+1000mg/L葡萄糖+960mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素,用前在37℃水浴鍋預熱。成熟液(OM):M199(Gibico)+1mmol/L丙酮酸鈉+25mmol/L谷氨酰胺+0.075U/mL尿促性腺激素(HMG)(Sereno)+10μg/mL17β雌二醇(17β-E2)+10ng/mLEGF+1%ITS+10%FBS,pH控制在7.2～7.4,用前置于CO2培養箱中預先平衡2h。胚胎培養液(mSOFaa):SOF+2%EAA(V/V)+1%NEAA(V/V)+1mmol/L谷氨酰胺+10ng/mLEGF+8mg/mLBSA(不含脂肪酸)+1%ITS+10%FBS,pH控制在7.2～7.4,用前置于CO2培養箱中預先平衡2h。1.3培養條件將收集的COCs在D-PBS中洗3次,分別放入盛有50μLOM液的30mm培養皿中,在38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養27h。將培養成熟的卵母細胞用PBS液清洗3次,放入含0.1%透明質酸酶的無Ca2+、Mg2+的PBS中消化2min,并用細管反復吹打除去卵母細胞外擴散的卵丘細胞,吹打干凈后,在PBS中洗3次,得到的裸卵在體視顯微鏡下,以異物針撥動卵母細胞進行觀察,統計第1極體排出的卵母細胞數。1.4離子霉素減量原激素類型化msofaa的體外培養將體外成熟的卵母細胞作為對照組,用離子霉素(Ionomycin)聯合6-DMAP激活。具體操作為:選擇成熟的卵母細胞在含有5μmol/L離子霉素的mSOFaa液中處理5min,然后在含有2mmol/L6-DMAP的mSOFaa中培養4h,再用培養液洗3次后進行體外培養。用mSOFaa進行體外培養,48h記錄卵裂數,5～7d記錄囊胚發育情況。1.5冷凍液+20%egs+20%dmso冷凍基礎液:M199+20%發情山羊血清(estrousgoatserum,EGS);冷凍平衡液:M199+20%EGS+10%DMSO+10%EG;冷凍液:M199+20%EGS+20%DMSO+20%EG+10mg/mL聚蔗糖(ficoll)+0.65mol/L蔗糖(sucrose)。將GV期或MⅡ期的卵母細胞用TCM199+20%EGS洗3次,然后移入冷凍平衡液,在34℃條件下平衡2～3min,再移入冷凍液中,隨機取少量卵母細胞用于毒性試驗,其余的將其放在含有冷凍液的銅環上,將冷凍處理時間分為20s和40s兩組,之后迅速將其投入液氮中冷凍保存。1.6卵母細胞的孵化培養把裝有卵母細胞的冷凍環倒入預先熱平衡好的0.25mol/L的蔗糖溶液中,并在38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育2～5min,然后將卵母細胞移入0.125mol/L的蔗糖溶液中并在38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下再孵育5min,然后用于成熟培養或孤雌激活。1.7卵母細胞的成熟和繁殖具體操作方法同1.3。1.8卵母細胞的單胞激活和培養具體操作方法同1.4。1.9統計分析試驗重復3次以上,試驗數據用SPSS軟件中的χ2進行分析。2結果與分析2.1冷凍組與對照組成熟率和卵裂率比較由表1可知,毒性試驗組和冷凍組的形態正常率與對照組相比差異極顯著(P<0.01),且解凍成熟培養后冷凍組的成熟率和卵裂率極顯著低于對照組(P<0.01);毒性試驗組的成熟率與對照組相比差異顯著(P<0.05),卵裂率無顯著性差異(P>0.05)。2.2對常率、孤成蟲卵裂率的影響由表2可知,由于受冷凍保護劑和凍存的影響,毒性試驗組和冷凍組的形態正常率與對照組相比差異極顯著(P<0.01);而孤雌激活后毒性試驗組的卵裂率與對照組相比差異不顯著(P>0.05),冷凍組的卵裂率顯著低于對照組和毒性試驗組(P<0.05);冷凍組和毒性試驗組均未發育到囊胚。2.3形態正常率、成熟率和卵裂率由表3可知,冷凍時間為20s和40s時,形態正常率和成熟率及卵裂率均無統計學差異;結果表明,在40s內完成冷凍程序對GV期卵母細胞的形態正常率、成熟率和卵裂率均無影響。2.4態正常率和卵裂率由表4可知,20s和40s在形態正常率和卵裂率均無統計學差異;結果表明,在40s內完成冷凍程序對MⅡ期卵母細胞的形態正常率和卵裂率均無影響。3冷凍保護劑的選擇由于常規冷凍操作復雜,耗時長,且需要昂貴的降溫設備,使得推廣受到一定的限制。因此,大部分研究人員更傾向于利用玻璃化方法研究卵母細胞的冷凍。Vajta等(2006)報道哺乳動物的卵母細胞和胚胎的冷凍保存在將來主要用玻璃化法。Burgos等(2011)研究結果表明,在卵母細胞冷凍中用程序化和玻璃化冷凍對卵母細胞DNA的損傷無顯著差異,但對卵母細胞的形態和減數分裂中紡錘體構型的損傷程度是前者顯著高于后者。因此,在本研究中直接選用玻璃化冷凍法。冷凍環冷凍法是使含卵母細胞或胚胎的冷凍液直接與液氮接觸,且所用冷凍液體積小于1μL,具有冷凍液用量少、冷凍速度快、細胞在冷凍中的成活率高等優點,因此,本試驗中采用銅環冷凍卵母細胞,其中銅環的直徑為10號針頭大小,以便于承載冷凍液和卵母細胞,且使銅環承載的冷凍液較少,從而減少冷凍液對卵母細胞的毒副作用。在冷凍液的篩選中,由于EG、PROH和DMSO等保護劑的化學性質不同,決定了其對細胞的毒性不一樣,保護的作用也有所差異(Lim等,1992;Burgos等,2011;陳玉等,2011)。在以前的諸多研究中都單獨采用3種溶液作為保護劑來冷凍卵母細胞或胚胎,而近幾年的研究都在充分考慮這3種保護劑相結合的優點,從而更進一步提高冷凍效果。Begin等(2003)用20%EG+20%DMSO冷凍劑凍存MⅡ期山羊卵母細胞,解凍后的卵裂率與正常組無顯著差異;Gautam等(2008)研究得出用20%EG+20%DMSO保護劑在冷凍水牛卵母細胞中的形態正常率、卵裂率及囊胚率均顯著高于其它組。所以,本試驗選用20%EG+20%DMSO為冷凍液。本試驗中比較研究了冷凍保護劑對云嶺黑山羊GV期和MⅡ期卵母細胞冷凍解凍后的形態正常率、成熟率及卵裂率等發育狀況的影響。研究結果表明,MⅡ期卵母細胞的冷凍效果明顯好于GV期卵母細胞,這與劉海軍等(2000)所得結論一致;而MⅡ期卵母細胞的卵裂率與對照組差異顯著這一點與Begin等(2003)研究結果不同,這可能是由于培養因素影響所造成的。總之,這些結果表明,山羊MⅡ期卵母細胞更適于冷凍保存,而GV期卵母細胞不適于冷凍保存。其主要原因可能是冷凍損傷了GV期卵母細胞的超微結構(胞質膜、皮質顆粒、線粒體、內質網等),致使解凍復蘇后仍難以完成一系列成熟過程所需的形態學和包括蛋白質合成在內的生物化學變化,而冷凍對成熟卵母細胞的超微結構損傷相對較小(孫青原等,1994;Gautam等,2008)。將卵母細胞在冷凍液中平衡處理,然后再放在承載有冷凍液的銅環上。而細胞與玻璃化液接觸多長時間,才能保證卵母細胞達到玻璃化而又使玻璃化液對卵母細胞的毒性作用降到最低,很難定論。大部分研究者都習慣采用30s左右的玻璃化時間(Chen等,1986;Eroglu等,1995;Azambuja等,1998;Zhang等,2005)。本試驗研究了20s、40s玻璃化時間對冷凍效果的影響,解凍后GV和MⅡ期各組均無顯著差異,表明玻璃化時間在40s內均不影響卵母細胞的活力和發育潛力。本研究中,采用玻璃化冷凍體系凍存山羊GV和MⅡ期卵母細胞,雖在形態正常率上獲得了較理想的凍存效果。然而,凍存卵母細胞的發育潛力還不是很