天然產物分離及分析概述第一章緒論第二章天然產物提取方法與技術第三章新型分離技術在天然產物分離中的應用第四章色譜技術在中藥質量控制中的應用第五章紫杉醇的提取分離參考書:(1)徐懷德，天然產物提取工藝學，中國輕工業出版社；(2)田頌九，色譜在藥物分析中的應用，化學工業出版社第一章緒論天然產物提取的特點天然產物的開發利用天然產物提取的技術進展天然產物提取過程的選擇天然產物分析的特點天然產物提取的特點天然產物化學：天然產物化學是研究動物、植物、昆蟲、海洋生物及微生物代謝產物化學成分的學科，甚至包括人體許多內源性成分的化學研究，它是在分子水平上揭示生命奧秘的重要科學。天然產物提取是運用化學工程原理和方法對組成生物的化學物質進行提取、分離純化的過程。天然產物提取的特點多學科性：生物化學、分子生物學、植物學、動物學、細胞學、微生物學等生物學科；有機化學、植物化學、天然藥物化學、天然產物化學等化學學科；化學工程、機械工程、化工原理等工程學科；以及其他應用學科。多層次性：提取、分離、純化、有機合成復雜性：生物材料組成、不穩定性常用方法物理方法：研磨、高壓勻漿、超聲波、過濾、離心、干燥等。物理化學方法：凍溶(用于細胞破碎)、透析、超濾反滲析、絮凝、萃取、吸附、制備色譜(吸附色譜法、分配色譜法、凝膠色譜法)、蒸餾、電泳、等電點沉淀、鹽析、結晶等。化學方法：離子交換、化學沉淀、化學親和、天然產物的結構修飾和化學合成等。生物方法：生物親和色譜、免疫色譜等。新技術：微波、超聲波萃取、樹脂吸附分離、微濾、超濾、納濾、親和膜分離、泡沫分離、超臨界流體萃取、分子蒸餾、雙水相分離、反膠束萃取等。現代生物技術：天然產物次生代謝物的調控和生產技術，微生物工程和生物細胞組織培養工程技術生產某些珍貴次生代謝產物，酶工程技術，基因工程技術的應用等。天然產物開發利用概況天然藥物：中藥、農藥、天然藥物食品工業：天然色素、玉米生產乙醇提取技術：雙水相萃取、層析分離、大規模制備色譜、膜分離、超臨界提取、微膠束萃取等。成分及功能天然產物提取方法選擇根據生產原料根據生物微觀結構根據天然產物的化學結構與化學性質多技術組合提取方法的前后統一天然產物加工的主要過程粉碎初步純化：各種沉淀法如鹽析法、有機溶劑沉淀、化學沉淀，樹脂吸附法、膜分離法、濃縮和脫鹽。高度純化：成品加工：干燥和結晶第二章天然產物的提取方法與技術天然藥物的研究(1)選定研究對象、(2)生物材料采集和品種鑒定、(3)文獻資料調研、(4)化學成分預試驗、(5)活性提取部位和活性化合物跟蹤分離和結構鑒定、(6)活性成分結構改造和構效關系、(7)藥理、(8)毒理、藥物代謝動力學、(9)制劑工藝(處方及工藝、質量分析與控制、穩定性實驗、生物利用度)、(10)臨床實驗、(11)中試、(12)正式生產等步驟。研究對象的確定總則：選題應與社會發展和需求密切相關，圍繞天然產物研究的趨勢和方向確定所研究的天然產物對象。根據古代醫學典籍、民族醫學實踐提供的資料或民間經驗和臨床觀察確定研究對象；根據當地植物樣品隨機選取研究對象；根據天然產物成分信息確定研究對象；在已有的天然產物、醫藥學及相關科學研究成果的基礎上，通過大量的文獻檢索確定研究對象；根據市場商品要求確定研究對象。相關文獻資料來源NaturalProdouctReport，1984，英國皇家化學會JournalofNaturalProduct，美國化學會與美國生藥學會合辦Phytochemistry，國際植物生物化學與天然有機化學的專業期刊JournalofAsianNaturalProductResearch，中國和日本合辦TheArchivesofPharmacalResearch，韓國藥學會主辦JournalofNaturalRemedies，印度主辦。JournalofEssentialOilResearch，美國主辦oPhytochemiealAnalysis，英國主辦。PhytochemicalReviews，英國主辦，歐洲天然產物學會會刊。Phytomedicine，國際植物療法和植物藥理學雜志，德國主辦。藥學學報，中國藥學會主辦o化學文摘(CA)Scirus-forscientificinformationonly。美國化學會網站，網址：。英國皇家化學會網站，網址：.天然產物提取方法的選擇植物化學成分：分離新化合物、鑒定新化合物的結構、發現新成分。天然產物提取：從工業生產的要求和實驗情況出發，使生產工藝流程簡單、經濟和可行，還要使提取收率高、產品質量高和成本低。分離純化：提取液中的成分復雜、目的物濃度較稀、與目的物理化性質相似的雜質多，所以不宜選擇分辨能力較高的純化方法。植物原料的提取根：中藥材中的根類藥材比較多，如人參、丹參、玄參、三七、大黃等。含有淀粉較多，不宜加熱提取。莖：粉碎后乙醇提取。樹皮與莖皮：含有膠質，用乙醇提取。干果：含有果膠，用有機溶劑提取。種子：破壞細胞壁，然后壓榨提取。花：干燥后細胞壁自動破壞，可以直接提取。花粉：發酵后提取。葉子：粉碎后提取或者用石油醚除去表面蠟層以后提取。不帶根的草本植物：粉碎后直接提取。動物原料的提取角類和骨類：角類原料常用的有犀牛角、羚羊角飛水牛角、鹿茸等。骨類原料有虎骨、豹骨等。動物角類和骨類都是由結締組織所構成的，角類實質上是動物裸露在外的骨，結構上沒有太大的區別。骨和角的組織很致密很堅硬，這種堅硬的組織是由膠蛋白所組成的膠原纖維所構成，它的基質是由磷酸鈣和碳酸鈣所組成。由于這種原因這類原料在加工前需要粉碎得細一些，只有這樣才能較順利地把有效成分提取出來。皮類原料：常用的有驢皮、黃牛皮和豬皮等。這類原料的組織是由膠質蛋白所組成，多用于制備阿膠、黃明膠和新阿膠。這類原料應用新鮮皮類，在加工時應先破碎，再用勻漿機類的設備制成漿狀物再進行加熱煮制，這樣可以縮短煎煮時間，提高質量。海洋生物材料海藻：10000多種，抗腫瘤、防治心血管疾病、治療慢性氣管炎、驅蟲。腔腸動物可從腔腸動物海葵中提取分離海葵毒素。節肢動物有蝦、蟹等，可從蝦皮、蟹殼中提取分離甲殼素。軟體動物：包括螺、貝、烏賊等。活性物質有多糖、多肽、糖肽、毒素等，它們分別具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、降血脂、止血和平喘等生理功能。棘皮動物：6000多種，包括海星、海膽、海參等。海參毒素有抗癌作用。爬行動物：海生的有海龜、海蛇等。海洋哺乳動物：鯨魚和海豚的臟器和腺體己制成多種藥物。細胞壁的破壞方法風干法：在通風良好不見直射陽光的條件下風干開始時，由于外界空氣的蒸汽壓或相對濕度較低，細胞壁先失水，隨后細胞質的液泡也要失水，細胞液的濃度不斷增高，并使漲壓減低并逐漸萎蔫，終致細胞受到破壞而死亡。加熱干燥法：將新鮮原料切片后加熱干燥，在干燥時水分急劇蒸發，細胞內原生質和蛋白質凝固、變性、細胞萎縮，使細胞膜和細胞壁破壞，改變細胞組織的滲透性。機械法：球磨法、高壓勻漿、超生法。非機械法：酶解法。原料的前處理除雜、洗滌、切割。原料的干燥。原料的粉碎。發酵和水解處理。脫脂處理。含有揮發性有的原料處理。以酶和蛋白質為主要成分的原料處理。傳統的提取方法提取的原理：滲透、溶解、分配、擴散。影響因素：粉碎度(20-60目)、提取溫度(<100℃)、濃度差、提取時間(0.5-1h)。浸出溶劑：水、親水有機溶劑、親脂性有機溶劑。溶劑的選擇總則：相似相容原理極性與浸出溶劑的選擇；水、一元醇和各種直鏈碳氫化合物；水、一元醇和糖；苷類化合物與水、醇關系；提取設備萃取法萃取原理：萃取設備萃取技術生物堿的純化：(1)改變溶液的pH，使生物堿在堿性條件下游離，在有機溶劑中有高的分配系數，可以用有機溶劑萃取與親水性雜質分離；(2)或以酸水處理含生物堿的有機溶劑，使生物堿成鹽，改變分配系數而轉入水層，與親脂性雜質分離。這樣反復處理，可使親水性和親脂性雜質除去；提高總堿的純度。天然產物提取中的破乳化變型法：針對乳狀液類型和界面活性劑的類型，加入相反的界面活性劑，使乳狀液轉型，在未完全轉型的過程中將其破壞。反應法：如已知乳化劑種類，可加入能與之反應的試劑，鈉皂加入鈣鹽等。對離子型乳化劑，因其穩定性主要是其雙電層維持可以加入高價電解質，破壞其雙電層和表面電荷，使乳狀液破壞。物理法：加熱是常使用的方法。離心法：主要是利用相對密度差異促使分層。離心和抽濾中不可忽視一個個液滴壓在一起的重力效應，它足以克服雙電層的斥力，促進凝聚。微波提取微波：300MHz-30GHz。特點：設備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、選擇性強、重現性好、節省時間、節省溶劑、節能、污染小等眾多優點，應用范圍已從最初的環境分析樣品制備迅速擴展到食品、化工和農業等領域。微波技術用于：提取生物活性成分已涉及到幾大類天然化合物(揮發油、苷類、多糖、萜類、生物堿、黃酮、單寧、甾體及有機酸等)。影響微波提取的因素溶劑：微波提取要求被提取的成分是微波自熱物質，有一定的極性，對微波透明或半透明。提取功率：200-1000W范圍內。提取時間：微波提取時間與被測物樣品量、物料中含水量、溶劑體積和加熱功率有關。由于水可有效地吸收微波能，較干的物料需要較長的輻照時間。超聲波提取超聲波：20KHz。利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度、增大介質的穿透力以提取生物有效成分的方法。機械效應超聲波在介質中的傳播可以使介質質點在其傳播空間內產生振動，從而強化介質的擴散、傳質，這是超聲波的機械效應。超聲波在傳播過程中產生一種輻射壓強，沿聲波方向傳播，對物料有很強的破壞作用，可使細胞組織變形、植物蛋白質變性；同時，它還可給予介質和懸浮體以不同的加速度，且介質分子的運動速度遠大于懸浮體分子的運動速度，從而在兩者之間產生摩擦，這種摩擦力可使生物分子解聚，使細胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑之中。空化效應通常情況下，介質內都或多或少地溶解了一些微氣泡，這些氣泡在超聲波的作用下產生振動，當聲壓達到一定值時，氣泡由于定向擴散而增大，形成共振腔，然后突然閉合，這就是超聲波的空化效應。這種增大的氣泡在閉合時會在其周圍產生高達幾千個大氣壓的壓力，形成微激波，它可造成植物細胞壁及整個生物體破裂；而且整個破裂過程在瞬間完成，有利于有效成分的溶出。熱效應超聲波在介質中的傳播過程也是一個能量的傳播和擴散過程，即超聲波在介質的傳播過程中，其聲能可以不斷被介質的質點吸收，介質將所吸收能量的全部或大部分轉變成熱能，從而導致介質本身和藥材組織溫度的升高，增大了藥物有效成分的溶解度，加快了有效成分的溶解速度。由于這種吸收聲能引起的藥物組織內部溫度的升高是瞬時的，因此可以使被提取的成分的結構和生物活性保持不變。超聲波提取的特點超聲波提取時不需加熱，避免了中藥常規煎煮法＼回流法長時間加熱對有效成分的不良影響，適用于對熱敏物質的提取；同時由于其不需加熱，因而也節省了能源。超聲波提取提高了藥物有效成分的提取率，節省了原料藥材，有利于中藥資源的充分利用，提高了經濟效益。溶劑用量少，節約溶劑。超聲波提取是一個物理過程，整個浸提過程中無化學反應發生，不影響大多數藥物有效成分的生理活性。提取物有效成分含量高，有利于進一步精制。影響超聲波提取的因素時間：超聲波提取通常比常規提取的時間短。超聲波提取的時間一般在10-100min以內即可得到較好的提取效果。超聲波頻率：超聲波頻率是影響有效成分提取率的主要因素之一。溫度：隨著溫度的升高得率增大，達60℃后，溫度如繼續升高，得率則呈下降趨勢。過濾影響因素：液體黏度越大，濾速越慢；黏度隨溫度升高而下降，故升溫可剮口濾速。濾材的毛細管越長，管徑愈小或數目愈少，則濾速愈慢。壓力愈大，濾速愈快；濾渣層越厚，濾速愈慢。沉淀中有膠狀物或其他可壓縮的物質，易堵塞濾孔，使濾速大大減慢。過濾設備(1)加壓葉濾機真空過濾機沉淀法鹽析沉淀法有機溶劑沉淀法鉛鹽沉淀法酸堿沉淀法鹽析沉淀法溶質：在溶液中加入中性鹽而沉淀析出。不同物質在高濃度的鹽溶液中溶解度不同來達到分離、提純的目的。鹽析作用的主要原因是由于大量鹽的溶入，使高分子物質失去水化層，分子之間相互聚集而沉淀。在生化產品生產中，許多物質都可以用鹽析法進行分離沉淀，如蛋白質、多膚、多糖、核酸等。鹽析法具有下列優點：成本低，不需特別昂貴的設備；操作簡便、安全；對許多生物活性物質具有穩定作用。在生化制備技術高度發展的今天，它與其他方法交替使用，仍是一種十分常用的純化手段。影響鹽析的因素離子強度：離子強度越大，蛋白質的溶解度越小。蛋白質的性質：蛋白質的結構和性質不同，鹽析沉淀要求的離子強度也不同。例如血漿中的蛋白質，纖維蛋白原最易析出，硫酸按的飽和度達20%即可；飽和度增加至28-33%時，球蛋白優先析出；飽和度再增加至33-50%時，擬球蛋白析出；飽和度大于50%時，白蛋白析出。pH：溶液的pH距蛋白質的等電點越近，蛋白質沉淀析出所需的鹽濃度越小。溫度：溫度升高一般可使蛋白質較易鹽析出來，但也有相反的情況。有機溶劑沉淀法有機溶劑對許多能溶于水的小分子天然產物以及核酸、多糖、蛋白質等生物大分子都能發生沉淀作用。有機溶劑的沉淀作用主要是降低水溶液的介電常數，如20℃時水的介電常數為80，而82%乙醇溶液的介電常數為40。對于具有表面水層的生物大分子來說，有機溶劑與水的作用不斷使這些分子表面水層厚度壓縮，最后使這些大分子脫水而相互凝集析出。不同溶質的沉淀要求不同濃度的有機溶劑，是有機溶劑分步沉淀的理論基礎。有機溶劑沉淀法的優點分辨能力比鹽析法高夕即一種蛋白質或其他溶質只有在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀；沉淀不用脫鹽，過濾比較容易；在生化制品生產中應用比較廣泛。其缺點是對某些具有生物活性的分子(如酶)容易引起變性失活，操作常需在低溫下進行。溶劑的選擇用于生化制品沉淀的有機溶劑的選擇首先是能和水混溶。使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酞胺、二甲基亞砜、2-甲基-2,4-戊二醇等。核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質的沉淀劑，最常用的是乙醇，對于蛋白質和酶的沉淀，乙醇、甲醇和丙酮都可以使用，但甲醇和丙酮對人體有一定毒性。核酸的有機溶劑沉淀，除乙醇外，異丙醇等也常被采用。其他一些有機溶劑如二甲基亞礬、氯仿、乙醚等，作為沉淀劑其應用的對象及條件則必須視具體情況而定。影響因素溫度：有機溶劑沉淀的操作過程宜在低溫進行，而且最好在同一溫度下進行，才能保證工藝的穩定性。樣品濃度：樣品濃度對有機溶劑的影響與鹽析情況相似，低濃度樣品使用有機溶劑的量大但共沉作用小，利于提高分離的效果；降低樣品濃度，樣品損失較大(即回收率小),具有生理活性的樣品易產生稀釋變性。pH：在樣品結構穩定范圍下選擇溶解度最低處的pH有利于提高沉淀效果。金屬離子：金屬離子以特殊的方式與許多蛋白質結合，其結果常使蛋白質的溶解度變低。離子強度：離子強度是影響溶質在有機溶劑與水混合液中溶解度的一個重要因素，鹽的濃度太小或太大都對分離有不利影響。鉛鹽沉淀法醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇中能與多種植物成分生成難溶的鉛鹽，故可利用這種性質使有效成分與雜質分離。中性醋酸鉛可以與酸性或酚性物質結合成不溶性鉛鹽，以此分離有機酸、蛋白質、氨基酸、粘液質、鞣質、樹脂、酸性皂苷或部分黃酮類化合物等。堿式醋酸鉛沉淀范圍更廣，除了上述能被中性醋酸鉛沉淀的成分外，還可以沉淀某些苷類、糖類及一些生物堿等堿性成分。因此，鉛鹽除能分離有效成分外，也可以沉淀雜質。鉛鹽沉淀方法：將提取液加過量的飽和醋酸鉛溶液至沉淀完全為了保證沉淀完全，過濾，沉淀用水洗，洗液與濾液合并，加堿式醋酸鉛溶液至沉淀完全，過濾，沉淀用水洗凈，合并兩次濾液，這樣就得到三部分分離物。脫鉛方法通硫化氫氣體，使鉛變成黑色硫化鉛沉淀出來，至濾液再通入硫化氫氣體不產生沉淀為止，過濾，沉淀用水洗凈，洗液與濾液合并，在水浴上加熱，驅除過量的硫化氫。加硫化鈉或磷酸鈉飽和水溶液，鉛變成硫酸鉛或磷酸鉛沉淀，至沉淀完全，過濾即可。加強酸性陽離子交換劑，在燒杯中攪拌也可脫去鉛離子。加磷酸或稀硫酸，調節pH為3，一生成難溶性硫酸鉛或磷酸鉛，過濾即可。各種方法的選擇①、③、④法脫鉛后濾液為酸性，對酸敏感的化合物不能采用，這時可以選用②法，但②法的產物中有無機鹽。①、③法脫鉛最完全，但①法在除去硫化氫時，常伴有極細的硫磺析出，難以過濾，此時可使用二硫化碳使之溶解除去。在采用③法時，要注意溶液中某些成分會同時被交換上去而使樹脂再生困難。用①法脫鉛時生成的硫化鉛會有吸附性，應給予注意。酸堿沉淀法利用某些成分在酸（或堿）中溶解、在堿（或酸）中沉淀的性質達到分離的方法。如橙皮苷、蘆丁、甘草皂苷，均易溶于堿性溶液，當加入酸后，可使之沉淀析出。生物堿一般不溶于水，遇酸可生成鹽類而溶于水中，再加堿堿化會重新生成游離的生物堿，從溶液中析出。其他沉淀法除了上述四種方法外，還有其他沉淀方法，如苦味酸、氫氧化鈉、氯化鈣、石灰、明礬等也能和有機酸、苷類及氨基酸等成分生成不溶于水的重金屬鹽沉淀，借以與其他化合物分離。某些蛋白質溶液，可以變更溶液的pH，利用其在等電點時溶解度最小的性質而使之沉淀析出。結晶法天然產物化學成分在常溫下多數是固體物