血管性血友病的研究進展

通常，血液可以在血液循環中呈液態，這是因為身體上存在相互排斥的凝血和抗凝血系統。由于物理、化學、創傷、感染、免疫和代謝等因素造成凝血和抗凝血系統的功能紊亂,可導致血栓形成。血栓形成涉及心血管內皮、血流狀態和凝血反應3方面的改變。首先,血管內皮受損是血栓形成最重要的因素,內皮細胞損傷后,內皮下膠原纖維暴露,與血小板膜相互作用使得血小板活化。各種不同的黏附蛋白分子如血管性血友病因子(vWF)和纖黏蛋白(FN)可富集在損傷區域。其中vWF主要由血管內皮細胞合成,是血小板在基質或血管基底膜的主要黏附蛋白。vWF可與血小板膜糖蛋白GpIb/Ⅸ復合物結合,也可與活化血小板膜上的整和素αⅡbβ3結合。它也含有與膠原和內膜下基質內糖胺聚糖的結構域,因此它通過架橋作用,促進血小板黏附,啟動凝血過程,導致血栓形成。其次,血流緩慢或有渦流時,血小板進入邊流,黏附于內膜的可能性大為增加,同時凝血因子也容易在局部堆積和活化而啟動凝血過程。渦流產生的離心力和血流緩慢,都會損傷內皮細胞,使其產生的內皮細胞合成前列腺環素(PGI2)和組織型血漿素原活化因子(tPA)等物質減少,從而抗血小板凝集、抗凝血和降解纖維蛋白的能力降低,也是導致血栓形成的原因。另外,血液的高凝狀態如DIC、手術、創傷、妊娠等引起的血液凝固性增高是血栓形成的又一原因。這3種條件往往合并存在,但常以某一條件為主。由于血栓性疾病的巨大危害性,對于血栓形成機制、血栓的診斷和抗血栓藥的研究便顯得尤為重要,因此建立簡單、快速、價格低廉而實用的動物血栓模型對于血栓性疾病的研究是十分必要的。本文對近年來較為常用的一些血栓動物模型加以介紹。1物理損傷法1.1血管內榨削法原理:刮匙搔刮損傷血管內膜,使內皮下細胞外基質(ECM)裸露,促使血小板與ECM(主要是膠原纖維)接觸而被激活和黏附。同時裸露的膠原纖維激活Ⅻ因子以及損傷的內皮細胞釋放出組織因子,啟動了內源性和外源性凝血過程,導致血栓形成。步驟:麻醉家兔后,分離其股深動脈,選擇直徑為1mm的股深動脈血管段,用微型血管夾夾住上下兩端,使其中間留有1.5cm長的血管段為手術部位。在實體鏡下,用7號針頭從血管段上端沿血管向下刺入血管段內并順勢注入生理鹽水沖凈血管內的血液,后抽出針頭,再用6號微型刮匙沿刺破孔送入血管內,反復搔刮血管內膜。搔刮深度以0.5~0.7cm為宜。搔刮面積盡可能大些,以刮出少量血管內膜為宜。稍等片刻,輕輕松動血管段遠端血管夾,使血液充盈血管。待刺孔不滲血時,取下血管段兩端血管夾(不能自行止血時可用0號無損傷線縫合刺破孔一針)。觸摸家兔膝內側皮下支動脈搏動示血管已通暢。然后逐層縫合,關閉皮膚切口。評價:此法依據血栓形成基本原理,在動物體內形成血栓,方法簡便、易行,成功率100%,術后24h即開始有血栓形成,也可用于制備靜脈血栓模型。主要適用于:1)動態觀察血栓形成過程中血栓形態及血栓變化規律的研究。2)評價藥物溶栓作用的實驗研究。3)與形成和溶解血栓有關的其他實驗研究。1.2股動脈血栓形成術組原理:股動脈內放置螺旋鋼絲線圈,造成動脈內膜損傷,局部血流動力學改變,激活凝血系統,促血小板凝集、釋放一系列活性物質,致血栓形成。步驟:麻醉雄犬后,分離其股動脈約7cm,從股動脈遠心端向近心端方向安插自制單股螺旋鋼絲(直徑0.5cm,長度1.5cm),進入血管內腔后,行血管縫合術,再用醫用生物黏合膠黏合。去動脈夾,確定血管再通充盈和手術視野無滲血,逐層縫合,術畢。評價:此法可靠易行,重復性好,血栓由血小板、白細胞及纖維蛋白構成。目前多用于血栓放射免疫顯像方面的研究。1.3ma直流電刺激動脈壁形成的血栓原理:1.5mA直流電刺激頸動脈壁可使血管損傷,血管內膜變得粗糙不平,引起血小板黏附聚集及釋放一系列活性物質,激活內源性凝血系統,同時受損內膜釋放的組織凝血活素可激活外源性凝血系統,于是動脈管腔內逐漸形成肉眼可見的混合血栓。步驟:麻醉大鼠后,頸部正中切口,剝離其右側頸總動脈約15mm長,用小塊塑料布遮蓋傷口附近的組織,防止組織溫度影響血管壁表面溫度及刺激電極與周圍組織接觸。刺激電極由2根直徑為1.3mm,間距1.7mm的不銹鋼棒組成,把刺激電極和溫度探子鉤于動脈內膜上。電流用1.5mA,刺激時間為7min。當血栓阻斷血流后,遠心端動脈溫度驟降,記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時間,稱堵塞時間(occlusiontime,OT),即為血栓形成時間。評價:一般認為,動脈血栓產生的決定因素是內皮損傷及高切率血流(如狹窄),在高切率區血栓成分以血小板為主,而低切率區以纖維蛋白和紅細胞為主。靜脈血栓產生的決定因素是內皮損傷,血液淤積呈高凝狀態,血栓主要成分是纖維蛋白、紅細胞和少量的血小板及白細胞。此實驗中形成的血栓成分在電刺激區以血小板及纖維蛋白為主,有少量紅細胞及白細胞,而在電刺激遠端以纖維蛋白及紅細胞為主,所以1.5mA直流電刺激動脈壁形成的血栓在形態結構上與人類動脈血栓相似,有較好的可比性,適用于抗血栓形成藥物的篩選,抑制血栓形成的藥物能延長OT值。此模型操作簡單,但受動物年齡、環境溫度等的影響較大,標準差較大,因而應用時有一定局限性。1.4血栓形成評定原理:粗絲線結扎下腔靜脈,引起局部血流淤滯、缺氧,導致血管內皮細胞損傷,啟動內源性凝血系統。此外,黏聚的血小板與局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部,致使血栓形成。步驟:麻醉大鼠后,開腹,分離其下腔靜脈,于左腎靜脈下方用粗絲線結扎下腔靜脈,縫合腹壁,結扎2~6h重新打開腹腔,在結扎線下方2cm處夾閉血管,剖開管腔,取出血栓,60℃烘干后稱量血栓質量,以血栓質量或血栓形成百分率為指標。評價:一般在結扎后2h血栓形成率約為60%~80%,此時處死動物主要觀察血栓形成百分率。6h后血栓形成率為100%,此時應觀察血栓質量。此方法多用于判定溶栓藥物的體內抗血栓作用。2化學損傷法2.1動脈血栓形成的檢測方法原理:胰蛋白酶具有蛋白水解作用,使血管內膜和部分肌層脫落,血小板黏附、聚集,致血栓形成。步驟:麻醉家兔后,暴露右側頸總動脈約2.5cm,用顯微外科動脈夾夾住近心端和遠心端,兩端分別插入8號針頭,于針頭進入部位結扎血管,兩結扎線相距1.5cm,經近心端針頭用輸液泵勻速(0.6mL/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。隨后以相同速度灌注生理鹽水沖洗,灌注液經遠心端排出,拔出針頭并用無創傷性針線縫合針孔,打開動脈夾使血流復通。評價:所形成的血栓富含血小板和纖維蛋白,類似于臨床上動脈血栓的形成。方法可靠,重復性好。用于抗血栓藥物的篩選和研究。2.2刺入動脈段內殘留血原理:過氧化氫損傷血管內膜,引起血小板黏附聚集,致血栓形成。步驟:家兔局麻后,分離其一側頸總動脈,以2個動脈夾夾閉此動脈,夾間距離約2.5cm,用4號針頭刺入動脈并固定,迅速抽出動脈段內殘留血液,并以生理鹽水反復沖洗3~4次至動脈段內無殘血。然后以10%H2O2溶液0.4mL分4~5次注入動脈段內連續作用10min,再以生理鹽水沖洗2~3次后,用黏合膠黏合針孔,放開血流。評價:所形成的血栓以白色血栓為主,符合動脈血栓的特征,可以用來探索防止血栓形成的方法。2.3血清學檢測大鼠內皮細胞損傷原理:角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質,是一種較強的致炎物質,其誘發的尾動脈局部血栓與血管內炎癥密切相關,炎癥時釋放的大量炎癥介質,如白介素-1、腫瘤壞死因子等可破壞正常內皮細胞維持凝血與纖溶之間的平衡作用,從而促發血栓形成;此外,內皮細胞損傷時舒血管物質如乙酰膽堿等分泌減少,縮血管物質如內皮素等增多,使局部血管痙攣,加重局部血管缺血缺氧狀況,進一步促進血栓形成及血管內皮損傷。步驟:昆明種雄性小鼠或SD雄性大鼠,角叉菜膠用生理鹽水配制成0.1%和1%,皮下注射。小鼠注射部位在腰背部,大鼠為后肢足跖部。注射3~14h后,多數動物尾尖部出現暗紅色血栓形成區,并逐漸向尾根部擴大。48~72h后局部從發紺變為黑色,隨后尾部干細斷落。評價:24h實驗動物尾部小靜脈和毛細血管內含有大量纖維素和少量白細胞及血小板,血管內皮細胞核濃縮呈骰子狀,血管內壁中性粒細胞靠邊。72h可見較大血管呈炎癥改變,伴有混合性血栓形成。由于血栓發生在尾部,界限明顯,可從體表觀察血栓形成出現的時間與發展過程,測量其波及的范圍或長度,可為研究體內血栓形成全過程提供一個簡便、直觀的動物模型。2.4動脈血栓模型原理:鐵離子侵入血管壁造成血管內膜損傷,血小板黏附聚集,血栓形成。步驟:大鼠麻醉后側臥固定,自眼眥和外耳道中線處剪一切口,暴露及除去顴弓,再暴露顳前窩及鱗狀骨大部分,然后在顴弓和鱗狀骨前聯合的前下方約2mm處鉆孔,開一約2mm直徑的小顱窗,暴露大腦中動脈,置一小片塑料薄膜保護血管周圍組織。將吸有50%三氯化鐵(FeCl3)溶液10μL的小片濾紙敷在該段大腦中動脈上20min,共敷2次后去掉濾紙。再用生理鹽水沖洗局部組織,逐層縫合。評價:方法簡單、可靠,重復性好,形成的動脈血栓成分為血小板、紅細胞及纖維蛋白等,為混合血栓。而且此方法仍保留有大腦中動脈,可進行血管觀察,較接近于臨床,且此模型既能反映抗栓藥又能反映溶栓藥的藥效,用已知的抗栓藥物阿司匹林和溶栓藥物尿激酶均驗證了這一點。該模型還可以利用TTC染色技術直觀地觀察腦梗死程度。其不足之處是動物的顴弓被去除,影響動物進食,不利于作長期觀察等,此法還有待改進。2.5動脈血栓模型原理:利用虎紅B(四碘四氯熒光素鈉)在單色綠光下產生并釋放單態氧,使血管內皮細胞膜上的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應,不僅使細胞膜的通透性改變,Ca2+內流增加,而且脂質過氧化物增加可破壞前列環素(PGI2)與血栓素B2(TXB2)的平衡,促進血小板聚集與黏附,激活凝血過程,形成血栓并進一步阻塞血管導致缺血;同時凝血過程中產生大量血管活性物質及神經毒性物質,破壞腦細胞尤其是血-腦脊液屏障,與人類腦梗死發生極為相似。步驟:麻醉大鼠后,經左側顳部入路,于左眼外眥和左耳外耳道連線上近眼外眥1/3處作一垂直的長約2cm的弧形切口,分離顳肌,去除顴弓,用拉鉤拉開下頜關節,在卵圓孔前上方用牙科鉆作一直徑為5mm的骨窗,切開硬腦膜即可見大腦中動脈(MCA),選擇MCA的近端(起始部)和從嗅束至大腦下靜脈間的一段MCA為光照部位,自制LG-150B冷光源的光纖端口距離MCA表面血管約5mm,將光纖所射出的光束垂直對準MCA,光照分2步,首先將光纖移至MCA起始部,經股靜脈注入1.5%虎紅B(2mL/kg)5min后,持續光照10min,然后將光纖移到嗅束至大腦下靜脈段MCA血管表面,再注入半量虎紅B,仍持續照射10min,至此血栓模型制作完畢。評價:此模型成功率100%,模型穩定、可靠,造模時采用分離顳肌、拉開下頜關節,保留術后鼠的咀嚼功能,提高動物存活率。采用分步照射法,在2次注射光敏劑時劑量減半,既可避免動物損傷程度過重,又可制備出較實用、可靠的大腦中動脈血栓模型。由于該模型的形成過程與人類腦血栓形成發病機制、血栓形成過程、損害程度較為相近,加之光照或光敏劑對血