棉花早熟性相關性狀的基因定位

新疆是中國的主要棉花產區，種植面積占中國棉花面積的一半以上。由于生長環境的特點（如有效積小、無光期短等），棉花品種通常很難正常成熟。因此，早熟是該地區棉花栽培的主要目標。經典的數量遺傳學研究表明,陸地棉早熟性是由多基因控制的數量性狀,其遺傳方式中除存在顯性、加性效應外,還存在上位性效應,與生育階段、開花時期、第一果枝節位、吐絮速率、霜前花率等性狀有關,且與產量、品質間存在顯著的遺傳負相關。及種內[22,23,24,25,26,27,28]遺傳圖譜,為研究棉花復雜數量性狀的遺傳機制和基因資源的發掘利用奠定了基礎。目前,國內外學者對棉花產量、品質、抗性等許多重要性狀進行了QTL定位研究,有關早熟性及其相關性狀的基因定位研究報道較少。范術麗等利用中棉所36×TM-1組合,定位了果枝始節、現蕾期、開花期、全生育期、霜前花率等控制熟性相關性狀的12個QTL;張先亮等定位了控制生育期性狀的5個主效QTL。Guo等定位了位于染色體16、21、25上的控制第一果枝節位的3個QTL。努斯來提等分別定位了位于染色體5和LG02上的控制第一果枝節位、始節高度和蕾期的5個QTL。Li等定位了控制第一果枝節位和始節高度的14個QTL,分別位于染色體A1、A5、A6、A9、A11、A13、D3、D6、A12/D12和LG1上。新陸早8號、新陸早10號是具有不同遺傳背景的新疆棉區種植的早熟陸地棉品種,全生育期均為120d左右,高產優質、抗病性好。本研究以新陸早8號、新陸早10號為母本,分別與陸地棉遺傳標準系TM-1配制雜交組合,利用兩組合的F2及F2:3分離群體對苗期、現蕾期、花鈴期、霜前鈴數和全生育期等早熟性相關性狀進行QTL定位研究;同時利用另外收集的43份早熟陸地棉品種材料(主要來自金字棉及前蘇聯衍生系)構成的自然群體進行關聯分析,探討了早熟性相關性狀的分子遺傳機理及其基因來源。以期為進一步挖掘與早熟性狀相關聯的優異等位變異及早熟陸地棉分子標記輔助育種打下基礎。1材料和方法1.1材料來源及種植情況新陸早8號、新陸早10號均由新疆生產建設兵團八師農業科學研究所育成,是20世紀90年代末北疆早熟陸地棉區域種植的主栽品種,其中新陸早8號是前蘇聯品種611波衍生系,而新陸早10號則為金字棉衍生系。用于關聯分析的早熟陸地棉材料(表1)主要來源于新疆生產建設兵團七師、八師農業科學研究所及中國農業科學院棉花研究所。2006年冬季在海南島分別以新陸早8號、新陸早10號作母本、以陸地棉遺傳標準系TM-1作父本配制雜交組合。2007年在南京農業大學江浦試驗站種植兩組合的親本、F1及43份陸地棉材料構成的關聯分析群體,并做自交留種。采用育苗移栽,隨機區組排列,單行區,重復2次。行長5.0m,行距0.8m,每行15株。2008年在八師農業科學研究所種植兩作圖群體的親本、F2及關聯分析群體,2009年種植兩群體的親本、F2:3家系及關聯分析群體。均采取完全隨機區組設計,重復2次。采用55cm(40+35+40)寬膜覆蓋,3行區,行長5.0m,株距16cm,家系和關聯分析群體材料每行均種植約30株。田間管理同一般大田管理。1.2壯苗期調查2007、2008和2009年分別在南京農業大學江浦試驗站和新疆建設兵團八師農業科學研究所調查了分離群體的親本、F1、F2和F2:3家系及關聯分析群體的早熟性相關性狀,即出苗后,從中行選擇5株(江浦)或12株(八師)壯苗掛牌定株,調查各株的出苗、現蕾、開花、吐絮等時期;在收獲期調查各株霜前吐絮鈴數,即霜前鈴數(pre-frostbolls)。根據不同生育時期計算各生育期,其中苗期(seedlingstage)為棉花出苗至現蕾天數;蕾期(buddingstage)為棉花現蕾至開花天數;花鈴期(floweringandbollingstage)為棉花開花至吐絮天數;全生育期(growthstage)為棉花播種至吐絮天數。取性狀均值用于數據分析。1.3分子ssr擴增篩選以本實驗室構建的飽和海陸種間遺傳圖譜為基礎,每隔一定距離(10cM)選擇一個標記,共選取覆蓋棉花全基因組的402對SSR標記引物對關聯分析群體進行標記基因型分析。將SSR標記擴增出的條帶量化,同一位點處等位基因的出現和不出現分別記為“1”和“0”,用于關聯分析。另用7331對SSR及EST-SSR引物對新陸早8號、新陸早10號2個作圖群體的親本進行多態性篩選,分別選出親本間呈現多態性的引物191和108對;用這些多態性引物對2個F2分離群體進行標記基因型分析,以阿拉伯數字“1”記為母本P1帶型、“2”為父本P2帶型、“3”為F1雜合帶型。用JoinMap3.0分析標記間的連鎖,構建分子遺傳圖譜。作圖函數為Kosambi函數。依據本實驗室框架圖將連鎖群定位到相應染色體上。采用WinQTLcart2.5的復合區間作圖法(compositeintervalmapping)進行早熟相關性狀的QTL定位。性狀的LOD值閾值經1000次排列測驗確定。LOD值3.0以上表示顯著性QTL,LOD值2.0~3.0表示可能性QTL。由曲線峰頂向兩側各下降1和2個LOD值來確定QTL的90%和95%的置信區間。采用水稻上常用的QTL的命名方法,以字母“q”開頭表示QTL,后接性狀名稱的縮寫,再接染色體或連鎖群的編號,最后是該染色體上控制此性狀的QTL序號。利用PowerMarker3.25分析關聯分析群體遺傳多樣性,獲得等位變異數目、等位基因頻率、基因型數目以及基因多樣性等參數值。應用Structure2.2,對所選棉花品種進行基于數學模型的類群劃分,并計算材料相應的Q值。利用TASSEL軟件包計算連鎖不平衡(linkagedisequilibrium,LD)配對檢測的矩陣圖,使用其廣義線性模型(generallinearmodel,GLM)程序,將各個體的Q值作為協變量分別對標記變異和每個性狀的表型變異進行回歸分析。2結果與分析2.1抗壞血酸性狀檢測在新陸早8號×TM-1組合(Pop1)的F2~F2:3中,檢測到早熟性相關性狀QTL14個,其中顯著性QTL8個(表2)。在新陸早10號×TM-1組合(Pop2)的F2~F2:3中,檢測到23個QTL,其中顯著性QTL13個(表3)。2.1.1新陸早8號的分子身份證和缺失基因出現的表現在Pop1兩個分離世代中檢測到控制生育期的2個顯著性QTL和3個可能性QTL(表2),分別位于染色體A2、D8、D12和連鎖群LG01上,LOD值為2.53~3.83,解釋表型變異的4.0%~7.0%。縮短生育期的等位基因均來自早熟親本新陸早8號,共縮短生育期8.7d。其中QTLq-GS-A2-1和q-GS-LG01的早熟等位基因分別縮短生育期2.8d和1.8d,其顯性效應分別縮短生育期2.1d和0.9d,而QTLq-GS-D12-1的早熟等位基因縮短生育期0.7d,但其顯性效應增加生育期2.0d。在Pop2兩個分離世代中檢測到3個顯著性QTL和5個可能性QTL(表3),分別位于染色體A5、A6、A7/D7、D1、D7、D8、D9上,LOD值2.64~3.58,解釋表型變異的4.3%~12.0%。減少生育期的多數有利等位基因來自于早熟親本新陸早10號,縮短生育期0.8~3.9d,但這些QTL的顯性效應能延長生育期0.6~5.5d,對早熟性不利。2.1.2有機溶劑來源在Pop1的F2:3家系中檢測到控制苗期的顯著性QTL和可能性QTL各1個(表2),分別位于LG03和A2上,LOD值分別為3.04和2.70,解釋表型變異的6.0%和5.0%。縮短苗期的等位基因均來自晚熟親本TM-1,分別縮短苗期0.76d和0.96d。其中QTLq-SS-A2-1的顯性效應延長苗期0.24d。在Pop2的F2:3家系中檢測到控制苗期的4個顯著性QTL和1個可能性QTL(表3),分別位于A6、D1和D8上,LOD值2.82~3.90,可解釋表型變異的7.0%~10.0%。縮短苗期的等位基因均來自早熟親本新陸早10號,能縮短出苗期0.81~1.16d。QTLq-SS-A6-1的顯性效應能縮短苗期0.24d,其余QTL的顯性效應均延長苗期。2.1.3縮短信托的等位基因和表型的分子在Pop1的F2群體中分別檢測到控制蕾期的2個顯著性QTL(表2),均位于連鎖群LG02上,LOD值分別為5.98和3.43,分別解釋表型變異的9.0%和10.0%。縮短蕾期的等位基因分別來自于TM-1和新陸早8號,縮短蕾期1.23d和1.33d,但其顯性效應分別增加蕾期0.66d和0.42d。在Pop2的F2群體中檢測到控制蕾期的2個顯著性QTL(表3),分別位于D7、D8上,LOD值為7.27和3.15,解釋表型變異的16.0%和5.0%。縮短蕾期的等位基因均來自早熟親本新陸早10號,分別能縮短蕾期1.24d和0.63d。其中QTLq-BS-D8-1的顯性效應能縮短蕾期0.42d。2.1.4有機溶劑和群體在Pop1的F2~F2:3群體中檢測到控制花鈴期的顯著性QTL和可能性QTL各1個(表2),分別位于A2和D9上,LOD值分別為3.69和2.65,解釋表型變異的7.0%和4.0%。縮短花鈴期的等位基因均來自于早熟親本新陸早8號,分別縮短花鈴期2.68d和1.23d。這2個QTL的顯性效應分別能縮短花鈴期1.89d和0.31d。在Pop2的F2~F2:3群體中檢測到控制花鈴期的2個顯著性QTL和4個可能性QTL(表3),分別位于A6、A6/D6、A7/D7、D7、D13上,LOD值2.62~4.54,可解釋表型變異的4.0%~12.0%。縮短花鈴期的多數有利等位基因來自于早熟親本新陸早10號,縮短花鈴期1.15~2.41d,但其顯性效應均延長花鈴期。2.1.5啟動群體中的表型變異在Pop1的F2~F2:3群體中共檢測到控制霜前鈴數的2個顯著性QTL和1個可能性QTL(表2),位于D1、D2、D7染色體上,LOD值為2.82~5.82,解釋表型變異的6.0%~9.0%。增加霜前鈴數的等位基因均來自晚熟親本TM-1,分別增加霜前鈴數0.04~1.52個。其中QTLq-PFB-D1-1的顯性效應增加霜前鈴數1.12個。在Pop2的F2群體中檢測到控制霜前鈴數的2個顯著性QTL(表3),位于D7、A6/D6上,LOD值分別為8.82和4.49,可解釋表型變異的16.0%和7.0%。增加霜前鈴數的等位基因均來自晚熟親本TM-1,分別增加霜前鈴數1.74個和0.92個。其中QTLq-PFB-A6/D6-1顯性效應可增加霜前鈴數0.92個。2.2品種基因型聚類分析用挑選的402對SSR引物,對43份早熟棉花品種進行多態性檢測,共篩選到174對多態性引物(43.28%),檢測到486個差異條帶。不同的SSR引物在43個品種間檢測到的差異條帶數不同,變幅為2~7個,其中92對引物各檢測到2個差異條帶,占差異條帶數的52.29%;57對引物各檢測到3個差異條帶,占32.75%;引物NAU5467、NAU5468、NAU5472和NAU5486分別檢測到7個差異條帶,位于D2、D5、D9和A9染色體上,位點多態信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC)變幅為0.15~0.76。所選早熟陸地棉品種基因多樣性指數平均為0.40,變幅為0.04~0.78;平均PIC值為0.33。以上結果表明,所選的SSR引物檢測的差異條帶數目和基因多樣性的跨度較大,但平均值較低,雖說明了研究材料在基因組水平上變異比較豐富,但也反映了陸地棉遺傳基礎的狹窄性。根據174個SSR標記的Nei’s遺傳距離聚類,在相似性系數0.03水平上大致將43個早熟棉花品種(系)分為8類(圖1)。其中,與貝爾斯諾有親緣關系的新疆棉區育成的品種新陸早3號、新陸早9號、新陸早15、新陸早16和具有斯字棉、金字棉、烏干達棉血統的遼棉5號、遼棉7號、豫棉5號、豫棉7號、錦棉1號、晉棉17、魯棉10號和湘棉13等17個品種聚為一類。這些品種反映了不同陸地棉系統之間相互交叉的現象。5個晉棉品種、遼棉8號和汾無195等7個品種聚為一類,這些品種均是金字棉衍生的早熟類型。塔什干2號、烏干達3號、中棉所8號和中棉所13等4個品種聚為一類,這些品種分別是前蘇聯、金字棉衍生系。黑山棉、中棉所10號、中棉所14、中棉所16等4個品種聚為一類,其中中棉所10號是從黑山棉中經過系統選擇育成,中棉所14、中棉所16是以中棉所10號為共同親本雜交育成的,均為黑山棉衍生系。新陸早1號、新陸早2號、新陸早4號、新陸早5號、新陸早7號、新陸早8號、新陸早10號等7個品種聚為一類,其中新陸早1號、新陸早2號、新陸早8號來源于前蘇聯品種611波,新陸早4號來源于司42,新陸早5號來源于岱字棉15,新陸早7號來源于塔什干2號,而新陸早10號來源于金字棉。這些品種均為新疆棉區育成的早熟品種,反映了新疆早期和近代早熟陸地棉育種中不同系統之間的融合現象。來自烏茲別克斯坦的品種KK1543和金字棉衍生的品種錦棉2號聚為一類。晉中169和晉中200各自劃分為一個類群,這兩個品種是分別從朝陽1號及窩及1號中通過定向選擇育成。2.3表型變異位點與5個不同環境的關聯利用3年2點4環境數據及各環境平均值分別進行關聯分析,共檢測到與5個早熟性相關性狀顯著關聯(P<0.01)的位點54個,分布在除A10和D13以外的所有24條染色體上,其中有21個位點同時與2個以上的性狀顯著關聯(表4)。與全生育期顯著關聯的位點共19個,其中位于A9、A11和D6上的3個位點BNL1317、NAU5428和NAU2687可在4個環境中同時被檢測到,位于A2、D1、D4和D12上的7個位點分別在2~3個環境中同時被檢測到,可解釋表型變異的9.64%~13.55%。與苗期顯著關聯的位點共有15個,位于A2、A3、A11、D1、D11和D12上的6個位點分別在2個以上環境中同時被檢測到,可解釋表型變異的9.36%~17.73%。與蕾期顯著關聯的位點共有18個,位于A2、A5、A7、A8、A9、D2、D5、D10和D11上的9個位點分別在2個以上環境中同時被檢測到,可解釋表型變異的9.57%~27.99%。與花鈴期顯著關聯的位點共有15個,其中位于A9、D4、D6上的3個位點BNL1317、NAU4058和NAU2687可在4個環境中同時被檢測到,位于A11、D7、D9上的3個位點分別在2~3個環境中同時被檢測到,可解釋表型變異的10.94%~28.07%。與霜前鈴數顯著關聯的位點共有15個,其中位于染色體D6、D8、D10、D11和D12上的6個位點可在2~3個環境中同時被檢測到,可解釋表型變異的12.05%~26.34%。一些位點與多個早熟性狀相關聯,如位于染色體D2上的位點NAU5467同時與全生育期、苗期、蕾期和花鈴期顯著關聯,在染色體D7上的位點JESPR297同時與全生育期、苗期和花鈴期顯著關聯。說明這些位點的有利等位基因的表達可能是組成性的,在不同的生育階段均發揮作用。3討論3.1品種系聚類分析結果難以同原系的鑒別基于DNA標記對棉花種質資源的遺傳多樣性分析,可獲得豐富的遺傳信息,為種質改良和新品種選育提供依據。本研究利用基本覆蓋棉花基因組的分子標記對早熟種質資源進行分析,除晉中169和晉中200與其他品種間的親緣關系較遠外,多數品種集中在金字棉系譜中,親本來源單一。反映出所選早熟陸地棉的親緣關系較近、遺傳多樣性較低。根據品種系譜可以看出,分子聚類雖然傾向于將具有共同親本或遺傳基礎相近的品種聚在一起,但沒有真正從來源上將品種區分開。究其原因,主要是所選品種相對較少,多態性低。多態性標記在不同染色體上的分布不均,試驗獲取的PIC偏低,也導致聚類結果難以同實際系譜相吻合。另外,不同早熟棉育種單位之間材料交流比較廣泛,基因的交換、重組及漸滲造成遺傳背景較為復雜,使得聚類分析結果難以與系譜衍生系分類信息相對應。相對于系譜分析,分子聚類結果對于陸地棉早熟育種的親本選配具有更大的指導作用。3.2新陸早8號組合的遺傳關系和多態性陸地棉早熟性是復雜的數量性狀,其遺傳方式也較為復雜,采用經典數量遺傳學研究方法得出的結論不盡一致,顯性、加性[8,10,11,12,13,14,15]、超顯性和上位性遺傳均有報道。本研究在Pop1中檢測到控制全生育期的5個QTL,來自新陸早8號的有利等位基因共縮短全生育期8.68d,顯性效應共增加全生育期0.20d。檢測到的蕾期和花鈴期的6個QTL中,來自新陸早8號的有利等位基因分別減少蕾期和花鈴期1.33d、3.91d,其顯性效應則延長蕾期1.08d、縮短花鈴期2.20d。在關聯分析中也檢測到能縮短生育期且與新陸早8號相關聯的等位變異。在Pop2中檢測到控制全生育期的8個QTL中,來自新陸早10號的等位基因共縮短生育期11.86d,但顯性效應共增加生育期25.61d。檢測到的苗期、蕾期和花鈴期的13個QTL中,來自新陸早10號的有利等位基因共縮短苗期、蕾期、花鈴期4.24、1.87和7.46d,而其顯性效應分別延長苗期4.12d、縮短蕾期0.35d、增加花鈴期12.47d。以上結果表明,新陸早8號組合的早熟性以加性效應為主,新陸早10號組合中控制苗期、蕾期的早熟基因也以加性遺傳為主,而控制花鈴期和全生育期的QTL顯性效應高于加性效應。兩個組合中除D8上控制全生育期的QTL所在的位置相同外,其他性狀QTL的位置均不同。由于新陸早8號和新陸早10號的早熟基因分別來自611波和金字棉,說明早熟性在這2個早熟祖先系列中是由不同的基因控制的。3.3結構材料和等位基因的篩選與傳統的QTL作圖方法相比,關聯分析省去了親本間多態性篩選、作圖群體基因型的鑒定等繁瑣工作,直接利用軟件處理表型數據與SSR等位變異,其QTL定位不依賴圖譜,方法簡單直觀。然而該方法的缺陷是不能估計QTL的具體位置及加性和上