慢性胃炎脾胃濕熱證與hsp70及nf-b炎癥通路的表達

作為一種內源性保護蛋白，熱休克酶70（hps70）對維持胃粘膜完整發揮著重要作用。由于gacb（nuclatb，nf-b）的激活，gacb的發現與胃粘膜炎癥密切相關。本研究以HSP70及NF-κB炎癥通路的表達為切入點,并以脾氣虛證為對照,探討慢性胃炎脾胃濕熱證發生的生物學機制,現報道如下。1數據和方法1.1acterpylusi,hp感染陽性者及年齡收集2007年6月至10月就診于廣州中醫藥大學第一附屬醫院消化內科門診屬于慢性胃炎患者51例,辨證為脾胃濕熱證者36例,其中幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染陽性者19例,Hp陰性者17例;男23例,女13例;平均年齡為(35.36±5.70)歲;平均病程為(1.90±1.00)年。辨證為脾氣虛證者15例,男5例,女10例;平均年齡為(33.31±7.35)歲;平均病程為(2.17±0.77)年。另招募正常志愿者8例作為正常對照組,男3例,女5例;平均年齡(31.88±2.23)歲。3組在性別、年齡以及脾胃濕熱證與脾氣虛證患者的病程之間差異均無顯著性意義(P>0.05)。1.2診斷及鑒別標準慢性胃炎的診斷采用中華醫學會消化病學學會制定的《全國慢性胃炎研討會共識意見》中的標準,脾胃濕熱證和脾氣虛證的辨證診斷參照《中藥新藥臨床研究指導原則》(試行)標準,Hp感染判斷參照2003桐城會議標準。1.3標準物質的包含符合上述診斷標準,年齡在18~50歲之間,自愿且能夠配合參加試驗的受試者,并簽署知情同意書。1.4合并用藥治療不符合上述診斷標準者;近1個月內使用過抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑及質子泵抑制劑治療者;合并消化性潰瘍、萎縮性胃炎、食管炎、食管靜脈曲張、肝炎、肝硬化等消化系統疾病者;合并有嚴重心、肝、腎、肺系等疾病者及孕婦、哺乳期婦女;年齡在50歲以上或18歲以下者。1.5實驗細胞和試劑鼠抗人HSP70單克隆抗體(由北京中杉金橋生物有限公司提供,批號:77091220),鼠抗人NF-κB/p65單克隆抗體(購自美國SantaCruz公司,批號:SC8008),兔抗人白細胞介素-8(IL-8)親和純化抗體(由博士德生物工程有限公司提供,批號:BA0996),兔抗人多克隆抗體腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(購自北京博奧森公司,批號:bs-0078R),GIF-XQ240型電子胃鏡及BX50F-3雙目顯微鏡(附帶自動照相裝置NikonE990)均由日本奧林巴斯公司提供。1.6療效判定標準各組受試對象均完成臨床觀察表,由專人詢問,對癥狀進行評定計分并填寫表格。為準確記錄患者癥狀,對于不容易準確判斷的舌象、脈象,均由2位以上有經驗的醫師復核。1.7胃黏膜組織病理學檢測各組受試對象均行胃鏡檢查,于胃竇距幽門2~3cm處的大彎和小彎鉗取胃黏膜組織共2塊,1塊立即進行Hp快速尿素酶和美藍法檢測,1塊放入40g/L多聚甲醛中固定,石蠟包埋,行胃黏膜炎癥、Hp感染病理組織學及上述各指標免疫組織化學標記檢測。1.8指標檢測1.8.1胃黏膜炎癥程度、活動度判斷標準采用常規蘇木素—伊紅(HE)染色方法進行。胃黏膜炎癥程度、活動度的判斷采用文獻標準,由2位病理醫師在同一設定條件和未知病理診斷情況下進行。1.8.2hp感染的檢測采用快速尿素酶和美藍法進行,兩種方法檢測均呈陽性者判斷為Hp感染陽性,而均呈陰性者判斷為Hp陰性,一陰一陽者不納入結果分析。1.8.3胃黏膜病理組織學檢測采用抗生蛋白鏈菌素—生物素(Streptavidin-BiotinComplex,SABC)免疫組織化學標記方法進行。HSP70、NF-κB、IL-8及TNF-α一抗的工作濃度為1∶100,并于4℃過夜,其他具體操作步驟按試劑盒說明書進行。胃黏膜上述指標表達染色指數的觀察采用北航圖像分析系統3000進行病理圖像分析。染色指數(I染色)計算:染色指數=染色強度×染色面積;按顯色強弱記錄為:陰性-0,弱陽性-1,陽性-2,強陽性-3;染色面積比為染色細胞數占總體細胞數的百分比。1.9統計學分析采用SPSSforWindows16.0統計軟件包進行數據的分析。以均數±標準差(x珋±s)表示,組間均數比較用t檢驗;多組間計量資料比較用方差分析,等級資料用秩和檢驗;相關分析用Spearman等級相關分析方法。顯著水平設α=0.05。2結果2.1胃黏膜hp感染降低脾胃濕熱證患者黏液糊大多量偏多而濁,部分伴糜爛或黏膜下出血點;其胃黏膜充血水腫及炎癥程度均重于脾氣虛證,但炎癥活動度則2組之間未見明顯差異。脾胃濕熱證與脾氣虛證患者胃黏膜Hp感染率相當,分別為52.78%和53.33%,但脾胃濕熱Hp陽性患者炎癥程度及活動度均較Hp陰性患者明顯,胃黏膜炎癥程度及活動度與Hp感染的相關系數分別為0.608和0.620,呈正相關;Hp陽性患者胃黏膜除固有層炎癥細胞浸潤、上皮破壞外,部分還可見淋巴濾泡形成。結果見表1~表4及圖1~圖2(見彩圖頁第669頁)。2.2胃黏膜與hp感染的關系脾胃濕熱證和脾氣虛證患者HSP70、NF-κB及IL-8蛋白水平的表達定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞核和胞漿,TNF-α蛋白水平的表達主要定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞漿;正常對照組各指標的表達主要定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞漿。脾胃濕熱證患者HSP70、NF-κB、IL-8及TNF-α表達均顯著高于脾氣虛證組(P<0.05)。從Hp感染與HSP70及NF-κB炎癥通路情況看,脾胃濕熱證Hp陽性患者HSP70、NF-κB表達顯著高于Hp陰性患者(P<0.05);盡管IL-8、TNF-α表達與Hp陰性患者之間未見顯著差異,但其表達也呈增高趨勢。本研究病例胃黏膜Hp感染程度與HSP70、NF-κB及IL-8表達的相關系數分別為0.322、0.288和0.277,呈一定程度正相關;與TNF-α表達的相關系數為0.064,未見明顯的相關性。結果見表5、表6及圖3~圖6(見彩圖頁第670頁)。3胃黏膜與hp感染的關系Hp是造成胃黏膜損傷的主要攻擊因子之一,與慢性胃炎、潰瘍甚至胃癌均具有明確的病因學聯系。作為重要的轉錄調控因子,NF-κB活化入核后能與炎癥反應基因啟動子部位的κB位點特異性結合,啟動和調節相關炎癥基因轉錄,在炎癥反應細胞因子網絡調節通路中起重要作用。研究顯示,Hp感染易導致NF-κB活化,而隨著NF-κB活化后在胃黏膜表達的增加,炎癥性細胞因子IL-8及TNF-α表達也逐漸上升,且后者還可進一步促進NF-κB的活化,產生級聯反應,從而使炎癥持續和放大,這與中醫認為“濕熱邪氣”具有熏蒸、粘滯以及致病隱匿、漸進和纏綿易反復的特點較類似。眾所周知,中醫在強調“邪氣”致病的同時,往往更加注重機體“正氣”的御邪能力。作為內源性保護蛋白,HSP70在維持胃黏膜的完整中有著重要作用。已有研究發現,Hp陽性患者胃黏膜HSP70表達隨Hp感染程度的加重而增強;HSP70可通過NF-κB通路調節脂多糖所誘導的炎癥性細胞因子的表達。筆者于此也曾提出Hp感染可能通過激活NF-κB通路,使相關炎癥因子過表達而致病,而HSP70則可能通過介導細胞保護,阻止NF-κB活化從而能一定程度提高胃黏膜對Hp和相關炎癥因子的防御和耐受能力的觀點。本課題組近期mRNA水平定量研究也提示,慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜HSP70及NF-κB的表達明顯高于脾氣虛證組和正常對照組。從本研究病例看,慢性胃炎脾胃濕熱證與脾氣虛證Hp感染率相當,但脾胃濕熱證Hp感染程度及胃黏膜炎癥程度較脾氣虛證為重,尤其以脾胃濕熱證Hp陽性患者的炎癥程度最重。脾胃濕熱證和脾氣虛證組患者胃黏膜HSP70與NF-κB及其下游炎癥因子IL-8、TNF-α蛋白水平的表達分別較正常對照組升高和下降;與正常對照組僅呈胞漿未活化狀態的表達不同,2組HSP70、NF-κB及其IL-8均呈胃黏膜上皮、腺體和固有膜活化后細胞核和胞漿的同時表達,且2組之間的表達存在著顯著性差異,一定程度體現了脾胃濕熱證邪氣亢盛與正氣奮起抗邪以及脾氣虛證正虛體弱不足以奮起抗邪的特點。從與Hp感染的相關性來看,胃黏膜炎癥程度和活動度以及HSP70、NF-κB及其炎癥因子IL-8表達均與Hp感染程度呈一定的正相關;但TNF-α表達與Hp感染程度未見明顯相關性,是否與TNF-α體內效應呈表達量依賴性有關,尚待進一步的探討。上述研究初步提示,慢性胃炎脾胃濕熱證的發生與HSP70和NF-κB及其炎癥通路相關;相對而言,Hp陽性脾胃濕熱證患者的炎癥反應最為明顯;具有胃黏膜保護作用的HSP70可能部分體現了機體正氣的作用,而NF-κB及其下游炎癥因子則可