蛋白質離子交換層析介質的分子模擬方法

決定生物分離過程效率的內在因素是生物分子和分離材料之間的分子相互作用。借助現代分子模擬技術和生物大分子結構數據資源,構筑合適的機理模型,可以加強分離過程中微觀分子相互作用的認識,從而促進分離過程優化和分離材料設計。基于靜電相互作用的離子交換層析是應用最廣泛的蛋白質層析分離技術,規模化應用的成果層出不窮,也建立了不少層析分離模型。然而,微觀分離本質認識的不足造成了模型分析普遍缺乏預見性,難以預估蛋白質分子在層析床層中的分離行為。針對這一狀況,國外學者嘗試引入分子模擬方法來考察蛋白質分離過程中的靜電相互作用,取得了一些進展。然而,微觀分子模擬計算往往與宏觀的分離行為相脫節,使得分子模擬計算的結果難以獲得應用。本文借助分子模擬技術來研究離子交換層析中蛋白質和功能配基間的靜電相互作用,以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶為模型對象,構筑合適的蛋白質-介質配基模擬表面,通過分子模擬計算表征靜電相互作用的能量參數,尋求靜電相互作用能和層析停留因子間的相關性,實現微觀分子模擬計算和宏觀分離現象的定量關聯。1材料和方法1.1pdb平臺獲得以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶作為研究對象。蛋白質的三維結構數據從ProteinDataBank(PDB)數據庫獲得,通過比較分析,選擇PDBID為1lse(蛋清溶菌酶)和2cga(牛胰凝乳蛋白酶)的三維結構數據。蛋白質大小分別為43×10-10m(蛋清溶菌酶)和50×10-10m(牛胰凝乳蛋白酶)。1.2離子液體輔助的雙向水合合法成效特點采用程序包MCCE、Delphi和GRASP等進行分子模擬計算。MCCE程序用于研究pH變化對于蛋白質分子中氨基酸殘基質子化的影響,獲得不同pH條件下的蛋白質三維結構數據。Delphi程序用于研究離子濃度對蛋白質周圍靜電勢的影響。采用點電荷模擬功能配基,形成離子交換劑內孔配基模擬表面,構筑蛋白質-介質配基模擬表面體系。采用基于Poission-Boltzmann方程的Delphi程序計算蛋白質和模擬配基表面間的靜電相互作用能,考察配基平面大小、配基密度、作用距離、作用方向、鹽濃度、pH等影響。2結果與討論2.1陽離子交換接枝基于文獻數據,計算了4種陽離子交換劑的性質,包括GEHealthcare公司的SPSepharoseFF、CMSepharoseFF和TOSOH公司的ToyopearlSP650M、ToyopearlCM650M結果見表1。介質孔徑范圍在2.5～8×10-8m之間,平均配基距離在6～8×10-10m之間。介質的平均孔徑遠大于蛋白質的大小,因而介質孔可以近似作為平面以簡化計算。另外,蛋白質大小明顯大于平均配基距離,也就是說一個蛋白質可以和很多數量的配基發生相互作用。為簡化處理,配基間距設定為7×10-10m。由于不同陽離子交換介質的結構是類似的,功能基團的頂部帶一個負電荷,如磺酸基、磺丙基、羧甲基、羧基等,而空間臂上所帶電荷較少。因此,本文將陽離子交換基團簡化為帶一個負電荷的原子,構筑點電荷網平面來模擬配基表面,根據蛋白質對象大小調整平面,配基間距均為7×10-10m。與溶菌酶作用的模擬平面是9×9配基組成,平面邊長為5.6×10-9m,略大于溶菌酶的直徑(4.3×10-9m);與牛胰凝乳蛋白酶作用平面是10×10配基組成,邊長為6.3×10-9m,略大于牛胰凝乳蛋白酶的直徑(5×10-9m)。2.2蛋白質-模擬介質平面相互作用模擬組成蛋白質的氨基酸電荷有差別,蛋白質表面氨基酸的分布也不同,因而蛋白質表面電荷特性存在明顯的區域分布,與模擬介質平面的相互作用會隨著作用方向的變化而改變。圖1和2分別給出了兩個蛋白質和模擬配基平面相互作用能隨作用方向變化情況。結果表明,配基平面在Z方向340°與溶菌酶作用能最大,而Z方向10°時牛胰凝乳蛋白酶作用能最大。這兩個最強相互作用方向作為后續計算的基礎,以考察其它因素的影響。2.3平面距離變化的模擬考察了最強作用方向時結合能隨蛋白質與配基模擬平面距離變化的情況(見圖3)。隨著間距的增大,兩者之間的結合能逐漸減小,而且成線性關系,該結果與文獻報道相符。2.4鹽濃度對結合能的影響離子交換層析分離蛋白質,一般在低鹽濃度上柱,采用增大鹽濃度實現蛋白質的洗脫。本文考察了鹽濃度對結合能的影響,如圖4所示。在低濃度時,結合能與鹽濃度的對數值之間呈現線性關系,當鹽濃度較高時,結合能達到一個穩定值。通過觀察電勢圖發現,隨著鹽濃度增大,蛋白質周圍靜電勢明顯減小,導致結合能顯著變小。2.5不同ph下鹽濃度對蛋白質-介質模擬平面間結合能的影響通過MCCE程序獲得蛋白質在不同pH條件下表面氨基酸殘基的帶電性。選取最強相互作用方向,計算了不同pH下鹽濃度對蛋白質-介質模擬平面間結合能的影響(如圖5)。隨pH增大,蛋白質表面正電荷減少,因此與帶負電荷的介質模擬平面的結合能顯著減弱,分子模擬計算的結果與層析規律相一致。2.6凝乳蛋白酶表達對陽離子交換層析的影響DePhillips等曾考察了多種蛋白質在陽離子交換層析中保留行為,提供了層析過程的的保留因子數據。采用其中的蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶在陽離子交換層析中保留因子數據,計算平衡常數,與相應條件下的分子模擬獲得的結合能進行關聯,結果如圖6、7。能量參數與平衡常數之間存在明顯的線性關系,特別在低鹽濃度。然而,不同介質顯示不同的關聯規律,強離子交換劑比弱離子交換劑具有更強的保留行為,表明采用帶有相同點電荷的模擬介質表面存在一定的局限性,無法描述配基間的差別,進一步考慮配基原子構成和電荷分布將改進計算結果。3離子化功能配基的模擬以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶為模型蛋白質,陽離子交換吸附劑SPSepharoseFF等為模型層析介質。通過分析介質孔徑和配基分布,采用點電荷模擬離子化功能配基,構筑蛋白質-介質配基模擬表面體系。運用基于Poission-Boltzmann方程的Delphi程序計算蛋白質和模擬配基表