il-6在應激性潰瘍中的表達及意義

迎性潰瘍是臨床上常見的疾病。現有的研究表明,中樞神經遞質、神經肽類物質以及下丘腦的某些核團均在應激性潰瘍形成過程中起重要作用。已證實,作為機體細胞免疫的主要效能分子-細胞因子,可通過腦-腸軸調節胃酸和粘膜上皮的平衡,參與胃潰瘍的形成和保護機制。近年來有關IL-6與胃潰瘍關系的研究不多,但在HP感染的胃炎、胃潰瘍患者胃粘膜中已發現有IL-6的陽性表達,并證實IL-6參與了炎癥過程中粘膜的免疫反應,與潰瘍的形成有關。作為一種應激反應的應答因子,IL-6在應激性潰瘍形成機制中的作用并不明確。本實驗采用WesternBlot和免疫組織化學的方法觀察大鼠束縛浸水應激潰瘍模型中腦組織和胃粘膜組織IL-6的表達及分布情況,從而探討IL-6在應激性胃粘膜病變中的作用。1材料和方法1.1bolt試劑盒SD大鼠24只,雌雄不拘,體重180～220g,由第四軍醫大學動物中心提供。Westernbolt試劑盒為武漢博士德公司提供。蛋白質標準品購自華美公司。兔抗大鼠IL-6多克隆抗體(英國PeproTechECLtd.產品)、兔抗c-fos多克隆抗體(美國SantaCruzInc產品)、EnVisionTMSystem,HRP,anti-Rabbit購自丹麥DAKO公司。1.2方法1.2.1胃指數測定SD大鼠隨機分成4組,分別為對照組、應激1h、3h、5h組,每組4～6只。實驗前禁食24h,自由飲水。束縛四肢并浸泡于20～23℃的水槽中,水深至劍突。應激后處死。參照以下方法測定胃潰瘍指數:出血點得1分;長度<1mm者得2分;1～2mm得3分;2～4mm得4分;>4mm得5分;若寬度>1mm時加倍。所得分之總和,即為該胃粘膜損傷指數。1.2.2根據認知疾病，大鼠腦和胃粘膜組織的蛋白質分析制備胃粘膜及腦組織組織勻漿,采用Westernbolt法進行蛋白質分析。1.2.3漸進性潰瘍，大鼠腦和胃組織中的il-6的表達用免疫組化方法檢測IL-6的表達,圖象分析儀進行半定量分析。1.2.4免疫組化反應和c-fos免疫組化的雙重反應將切片進行c-fos免疫組化反應,硫酸鎳胺顯色,用PBS充分漂洗后繼續進行IL-6免疫組化染色,DAB顯色。1.2.5統計處理采用第四軍醫大學統計教研室的SPLM軟件對實驗結果進行方差分析或用兩組均數t檢驗處理。2結果2.1組織病理學檢測HE染色見大鼠應激性的潰瘍病變可以發生在胃的任何部位,潰瘍形成比較表淺,粘膜上皮脫落,組織水腫,胃腺細胞排列紊亂,潰瘍底無肉芽和瘢痕組織,僅有散在的淋巴細胞,單核細胞、中性粒細胞及嗜酸細胞的浸潤。2.2應激大鼠應激后il-6表達變化SDS-PEAG電泳可見腦組織及胃粘膜組織的蛋白帶分布不同,與正常大鼠相比,應激后均有一些新的蛋白產生,在分子量21～30ku之間有兩條新的蛋白帶,其中一條的分子量約為26ku,Westernblot采用特異性抗IL-6多克隆抗體證實為IL-6(圖1)。2.3應激大鼠腸道il-6免疫反應陽性細胞分布的表達及分布免疫組化染色結果顯示IL-6陽性顯色為棕黃色顆粒,主要見于胞漿。在中樞神經系統,免疫反應陽性細胞分布于應激大鼠下丘腦水平的神經元和細胞中,在室旁核分布尤為密集,細胞為多角形或小圓形,在視前大細胞核中可見神經細胞細長的突起,多為膠質細胞。在消化道,IL-6免疫反應陽性細胞主要分布于應激大鼠胃潰瘍周邊、胃組織粘膜下1/3近基底層處,潰瘍邊緣細胞免疫染色最強,細胞主要是圓形或卵圓形。腦和消化道內IL-6樣免疫反應陽性細胞形態多樣、大小不等,免疫反應強弱不同,可能反映了細胞功能狀態不同和種類的多樣性。2.4胃體可以瘺點,胃竇卵圓形,圓形潰瘍,出血加重表達的關系束縛浸水應激所造成的潰瘍主要分布于胃體,潰瘍的產生與時間有關。應激1h可見胃粘膜呈紫紅色,輕度淤血,有少量的出血點。以后淤血不斷加重,3h即可見明確的胃體線狀潰瘍和胃竇卵圓形及圓形潰瘍,5h出血加重,部分潰瘍融合成片狀。圖像分析和鏡下觀察發現腦及胃的IL-6陽性細胞數和陽性物質含量呈時間依賴性改變,結果表明,在應激性潰瘍的形成過程中,隨著應激時間的延長,IL-6的合成增多,胃粘膜的損傷加重(圖2)。2.5應激性潰瘍大鼠腦c-fos的表達及IL-6和c-fos在下丘腦神經元的共存光鏡下觀察,c-fos蛋白免疫陽性物質呈深藍黑色,位于神經細胞核內,以室旁核(paraventricularnucleus,PVN)最為密集,主要存在于室旁核小細胞部,其他部位也有c-fos蛋白的表達但弱于室旁核。雙標結果,通過觀察和計數,發現約有10%～15%的IL-6陽性神經元細胞表達c-fos蛋白,這類雙重反應細胞多呈圓形或梭形,胞核呈深藍黑色,胞質為棕黃色(圖3)。3神經損傷對應激性噬菌等免疫組化的作用近年來研究發現,許多原來由外周免疫細胞產生的細胞因子具有神經生物學效應。在腦內也發現了這些細胞因子的分布,如IL-1、IL-6、IL-3、IL-8、TNF-α等,其表達水平受內環境變化的影響。關于中樞這些細胞因子的來源,有人認為最有可能的就是神經細胞或膠質細胞直接或間接受到外界神經和體液因子的刺激時,本身就能分泌一些細胞因子向中樞傳導信息,參與宿主對疾病的中樞控制。已有的研究表明,IL-6不僅具有促進神經細胞生長和中樞的致熱作用,而且還與下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活有關。我們在實驗中發現應激鼠下丘腦IL-6的表達提示中樞內源性的IL-6可能參與了應激過程中某種病理生理機制。神經膠質細胞可認為是腦內的免疫細胞,執行一定的免疫功能,星形細胞為膠質細胞的主要成分。星形細胞受到一些因素影響時可分泌眾多的活性成分,如IL-1,IL-6等,這些成分作為免疫介質或炎性介質作用于大腦,參與其免疫生理和病理反應。本實驗發現在束縛浸水應激的大鼠下丘腦室旁核中可表達較高水平的IL-6,并且隨著應激時間的延長,其相對表達量亦升高,分析中樞IL-6可能通過興奮某些神經傳導機制參與應激性潰瘍的形成。目前發現消化性潰瘍除在潰瘍局部有嚴重的反應外,同時還伴有胃粘膜的彌漫性炎細胞浸潤,細胞因子是介導炎癥反應的主要介質。已有研究表明,在非固醇類抗炎藥物、Hp感染、應激等導致的急性胃粘膜損傷中細胞因子起著很重要的作用。IL-1、IL-6、IL-8、TNF等在中性粒細胞的趨化、激活、聚集以及溶酶體酶的釋放過程中發揮其生物學作用。一些非淋巴樣細胞在一定的刺激條件下也可分泌IL-6。本實驗發現大鼠胃粘膜IL-6陽性細胞分布于整個粘膜層和粘膜下層,從細胞的形態和分布分析多為巨噬細胞和肥大細胞。在應激性潰瘍的形成過程中,粘膜損傷越重,IL-6表達的相對含量越高,說明IL-6與胃粘膜的局部免疫反應有關,它可能參與了應激性潰瘍過程中炎性細胞的趨化、激活、和浸潤過程。c-fos蛋白作為細胞信使,盡管其作用具有多效性和非特異性,但它作為神經元被激活的標志,仍可有效的用于神經通路的追蹤和信使傳遞途徑的研究。本實驗發現下丘腦室旁核內c-fos蛋白的強烈表達,提示室旁核在應激反應中的關鍵性作用,以往的研究表明,損毀室旁核可導致應激反應的基本消失,而電刺激室旁核有加重大鼠應激性胃粘膜損傷的作用,充分說明了c-fos表達和神經元功能變化之間的直接關系。室旁核小細胞部(pPVN)是參與應激反應最重要的核團之一,此處的促腎上腺皮質激素釋放因子(corticotropin-releas