酵母表面展示技術簡介淺談酵母表面展示技術摘要：酵母表達體系同時具有真核細胞翻譯后蛋白加工修飾的過程與原核表達體系的特點，因此，以酵母為基礎的表面展示體系在諸多展示系統中有獨特的優勢。本文主要對酵母細胞展示的理論基礎、展示體系類型及應用研究的進展等進行了初步探討。關鍵字：酵母、表面展示、凝聚素、GPIScott和Smith在1985年通過發現短肽鏈可以融合到絲狀噬菌體的錨定蛋白上，卻不影響其感染大腸桿菌的能力，最早提出表面展示技術，促進了噬菌體表面展示系統的發展［1］。自從絲狀噬菌體表面展示技術創立以來，表面展示技術在很短的一段時間內得到快速發展，不同的實驗室又分別發展T4噬菌體、T7噬菌體、細菌、桿狀病毒、酵母等表面展示系統。微生物細胞表面展示是通過將靶蛋白基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導入微生物宿主細胞，靶蛋白在載體蛋白的引導下表達并定位于微生物細胞表面，保持相對獨立的空間構象和原有的生物學活性。微生物細胞表面展示系統包括細菌展示系統、噬菌體展示系統以及酵母展示系統。最早研究且比較成熟的系統是噬菌體展示系統，它是將外源的多肽與絲狀噬菌體的次要外殼蛋白融合并展示在外殼表面，噬菌體展示系統目前主要用于從復雜的文庫中分離特異性的配體、抗原、抗體，由于噬菌體顆粒較小，展示蛋白的大小和數量均有限。原核蛋白主要用細菌展示系統展示，革蘭氏陰性菌外表面有外膜，外源蛋白與暴露在細胞表面的夕卜膜蛋白、脂蛋白、菌毛蛋白或鞭毛蛋白的末端融合后得到展示［2］。酵母展示系統是比較理想的、應用最廣泛的展示系統，其優勢在于：遺傳操作方便；能對表達的夕卜源蛋白進行折疊、糖基化等翻譯后修飾，因而適宜表達真核蛋白；另外，酵母可以在廉價的培養基中培養達到很高的細胞密度。1酵母表面展示系統原理細胞表面是細胞內外的功能界面。一些表面蛋白橫穿過質膜，另—些以共價或非共價結構與細胞表面復合物結合一起。細胞能夠錨定特定的表面蛋白，并且能將其限制在細胞表面的特定區域。在生物技術中，細胞表面通常用于研究蛋白跨膜的機理。酵母細胞表面展示技術是近年來發展較快的一種真核蛋白表達系統，其基本原理是將外源靶蛋白基因（外源蛋白）與特定的載體基因序列融合后導入酵母細胞，利用酵母細胞內蛋白轉運到膜表面的機制使靶蛋白固定化表達在酵母細胞表面，在醫藥、食品、生物燃料等多個工業領域都有廣泛的應用前景［3］。2酵母表面展示系統基本組成2.1宿主細胞釀酒酵母一直被認為是安全的模式生物（GRAS）而廣泛應用于食品工業和醫藥工業，也是目前常見的用于酵母表面展示的宿主細胞。除釀酒酵母外，近年來酵母展示平臺已被拓展至某些能利用甲醇作為單一碳源和能量來源的細胞株，如巴斯德畢赤酵母、漢遜酵母。與釀酒酵母相比，嗜甲醇酵母細胞株具有更優越的發酵特性，如能夠在廉價的碳源中生長和更高的細胞培養密度，這些特性使其在需要大規模發酵的應用中更具優勢，例如展示異源酶作為全細胞催化劑［4］。另外，畢赤酵母對外源蛋白的O-糖基化程度更高，因而對展示的外源酶具有更好的穩定效果。2.2載體蛋白酵母細胞表面包被著一層堅硬的細胞壁，由內層的葡聚糖骨架和夕卜層的甘露糖蛋白構成。甘露糖蛋白主要包括兩類蛋白質：一種以非共價方式松散地結合于細胞壁，可以用SDS抽提；另一類蛋白必需以8-1,3或8-1,6葡聚糖酶消化細胞壁后才能抽提，這類蛋白常含有GPI錨定區域°a-凝集素和絮凝素以及細胞壁蛋白如Cwplp,Cwp2p,Tiplp等都屬于GPI家族蛋白，外源蛋白與它們融合后可被共價錨定于細胞表面，這些蛋白是常用的酵母表面展示載體蛋白。2.3夕卜源蛋白酵母表面展示系統適合展示各種真核蛋白，包括酶、細胞識別因子、受體、抗體、抗原等，被廣泛地應用于蛋白質工程、全細胞催化、生物轉化、細胞吸附、分子識別、生物治療、信號轉導、生物傳感器和疫苗等領域。夕卜源蛋白與載體蛋白的融合方式有C末端融合、N末端融合、插入融合。對某些外源蛋白，選擇恰當的融合方式可以明顯改善展示效果或蛋白的功能特性，如Aga2p蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以N末端或C末端兩種方式與其融合。研究表明抗CD3s單鏈抗體融合于Aga2p蛋白C末端時，其親和力較天然蛋白降低30?100倍［5］，而融合于N末端時活性得以恢復。3酵母表面展示系統的類型目前，最常見的酵母表面展示表達系統包括:凝集素展示表達和絮凝素展示表達［6］。凝集素展示表達系統是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列（含GPI錨定信號序列）連接后插入質粒載體的信號肽下游，融合蛋白誘導表達后，信號肽引導嵌合蛋白向細胞外分泌，由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細胞壁中，從而將蛋白分子展示表達在酵母細胞表面。絮凝素展示表達系統利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達在細胞表面，此系統又包括兩個子系統:GPI錨定系統和絮凝結構域錨定系統。GPI錨定系統是利用絮凝素Flolp的C末端含有的GPI信號錨定外源蛋白，此系統與凝集素展示相似;絮凝結構域錨定系統是利用Flolp的中間絮凝功能結構域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結構域識別酵母細胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價作用誘導細胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。4酵母表面展示系統的應用4.1酵母表面展示與酒精發酵傳統的酒精發酵是以淀粉質谷物或糖蜜為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長，以天然纖維素類資源生產酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質是自然界中一種潛在的可再生資源，對解決未來能源問題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發酵具有重要意［7］。Fujita等［8］成功地將三種纖維素水解酶同時展示在釀酒酵母表面，從而構建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細胞生物催化劑。4.2酵母表面展示系統與新藥篩選將未知功能的目的基因產物或特定病理過程相關蛋白產物展示在酵母表面，對cDNA表達文庫或突變體庫進行篩選，能發現與這些未知功能的基因產物或病理過程相關產物發生相互作用的物質，有助于對未知基因功能的研究，并能發現一些藥物作用的新靶點，或篩選到治療疾病的新藥先導化合物［9］。Visintin等［10］將酵母表面展示技術與酵母雙雜交技術相結合，將抗體的scFv片斷連接到轉錄因子VP16的激活結構域(AD)上，將抗原連接到LexA的結合結構域(DB)上，以His3和LacZ為報告基因，建立抗原抗體相互作用的展示方法。當抗原-抗體發生相互作用時，AD和DB的結合將啟動報告基因的表達，可通過營養缺陷培養基進行檢測。這種方法從scFv突變體展示庫中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺。4.3酵母細胞表面展示與生物吸附環境污染物的生物修復是以酶促降解或生物吸附為基礎的，例如微生物對重金屬的吸附就包括兩種途徑:(1)與細胞表面復合物結合，逐漸吸收在細胞內進行消化。然而通過胞內消化降解有毒物質必須使細胞內酶，蛋白質或污染物跨越細胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復利用。利用表面展示技術能較好地解決這一問題，吸附蛋白直接展示在細胞表面，不僅使吸附過程快捷高效還可以利用回復劑如EDTA對其進行處理使之不斷重復利用。4.4酵母表面展示與酶技術酶的固定化是指借助物理或者化學方法將酶固定于特殊的相，使得酶與整體流體分開，但是仍然能夠進行底物和效應物分子交換并發揮其催化效能的一種技術。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩定性，并使酶能夠反復回收利用。但是，傳統的固定化方法也會產生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，導致酶固定化過程中的活性收率損失；另外由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費和固定化操作費用［11］利用表面展示技術將具有催化活性的酶展示于酵母等微生物細胞表面就形成了全細胞催化劑，與傳統的細胞內酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共價或非共價方式固定于細胞外表面，這種獨特的空間定位使其相對自由酶而言有許多優良的特性，如溫度、有機溶劑穩定性、可多次重復使用等，這些特點與傳統的固定化酶技術相似，但無需額外的蛋白純化和固定的操作，有著良好的應用前景。Katsumi[12]利用a凝集素系統將來源于產黃菌屬的OPH展示于酵母細胞表面，細胞熒光強度測量表明每個細胞表面可以展示1.4x104個OPH分子，酵母展示系統OPH酶活性較大腸桿菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，為有機磷化合物的脫毒提供了一種有效的生物催化劑。5結語近十年來酵母表面工程技術在生物技術領域得到迅速發展，酵母表面展示系統不僅能展示單個亞單位蛋白，而且能展示異源寡聚體多亞單位蛋白。酵母是真核生物，利用酵母為宿主展示表達的各種蛋白為人們研究和操作復雜真核蛋白成為可能。另外，細胞代謝工程技術的進步使人們有能力通過增加或刪除細胞內一些酶進而改變某些代謝途徑某或創造新的代謝途徑，該技術與細胞表面工程技術相結合，使表面工程酶細胞不僅僅作為單步反應的催化劑，而且可能被改造成為能催化多步反應、適合廣泛用途的“細胞工廠”。總之，隨著更多展示載體蛋白及宿主細胞的發現，高效展示文庫篩選方法的建立以及人們對表面展示技術認識的不斷深化，酵母表面展示技術必將在生物質能源、生物化工、環境污染治理等領域得到廣泛應用。參考文獻A.Kondo,M.Udea.Yeastcellsurfacedisplayapplicationsofmoleculardisplay.ApplMicrobiolBiotechnol,2004,64:28-40郭波，謝佩蓉等.酵母表面展示系統研究進展.生物化學與生物物理進展,2002,29(1):9-22ShibasakiS,MaedaH,UedaMAnalSci2009,25(1):41-49KatoM,FuchimotoJ,TaninoT,etal.Preparationofawhole-cellbiocatalystofmutatedCandidaantarcticalipaseB(mCALB)byayeastmoleculardisplaysystemanditspracticalproperties[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2007,75(3):549-555Wang乙MathiasA,StavrouS,etal.AnewyeastdisplayvectorpermittingfreescFvaminoterminicanaugmentligandbindingaffinities[J].ProteinEngDesSel,2005,18(7):337-343葉波，林影、韓雙艷.工業微生物，2007,37(6):53~58伍世文.天然纖維素類物質的糖化及轉化為酒精的研究。西部糧油科技，2000,25(3):46-48YasuyaFujita,JunjiItoetal.SynergisticSaccharificationandDirectFermentationtoEthanolofAmorphousCellulosebyUseofanEngineeredYeastStrainCodisplayingThreeTypesofCellulolyticEnzyme.ApplEnvironMicrobio,Feb.2004:1207-1212KiekeMC,ChoBK,BoderET,etal.IsolationofantiTcellreceptorscFvmutantsbyyeastsurfacedisplay[J].ProteinEng,1997,10:1303-1310VisintinM,TseE,AxelsonH,etal.Selectionofantibodiesforintracellularfunctionusingatwohybridinvivosystem[J],ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:11723-11728[11]RoesslU,N