中樞神經系統神經元軸突再生的研究進展

傳統觀點認為，在中樞神經系統損傷后，無法修復或再生。1981年，根據agaso等人的研究，損傷后的cns軸突可以在適當的環境下再生。然后，在cns損傷后，回歸的概念被提出，并在隨后的研究中得到證實。目前研究的成果認為:脊髓損傷后限制神經軸突生長或再生的因素可分為兩類:一是神經營養因子和支持引導神經生長的基質成分缺乏;二是脊髓斷端產生的囊腔和瘢痕組織以及一些抑制性生長因子等抑制軸突生長。因此,創造損傷修復的最佳微環境是解決此問題的首選方法。本文就目前脊髓損傷微環境方面的研究現狀做一綜述。1軸突生長促進因素1.1ntf基因修飾細胞移植治療髓傷1952年Levi-Mnotacini首次發現并證實了NGF對再生的軸突有刺激生長作用后,對神經營養的研究成為一個活躍的研究領域。目前已知的NTF有20余種。大量研究證實,在損傷后的神經系統,NTF可以促進神經元存活和軸突再生。Bregman等在脊髓橫斷處植入含有BDNF或NT-3的明膠海綿后發現BDNF和NT-3能明顯抑制脊髓損傷引起的紅核神經元萎縮。Blesch分別把BDNF和NT-4/5基因修飾的細胞導入脊髓損傷處,結果顯示表達的BDNF和NT-4/5主要促進脊髓下行神經纖維再生及運動功能的恢復。采用NTF基因修飾細胞移植治療脊髓損傷已被公認為最新、最有前途的治療方法之一。過去10年中,圍繞基因治療,雖然在許多遺傳性基因缺陷疾病或癌癥治療上有了顯著進步,但在脊髓損傷方面仍是相當前沿的科學。1.2補償后的創造GAP-43是神經組織特異性磷酸蛋白,主要分布于神經元、再生的施旺細胞和神經膠質細胞,被認為是神經元軸突生長發育和可塑性的分子標記物。GAP-43可促進神經元的生長發育及突觸的重構,在神經損傷后修復時,軸突內GAP-43的含量可增加20~100倍。GAP-43高表達被認為是神經生長修復的典型特征。GAP-43表達的調控機制尚不清楚,推測GAP-43表達與轉錄后的調節密切相關。Schmidt-Kastner等研究損傷后GAP-43不是無限量無限期的增加,它在損傷的早期即刺激強度較大時增加明顯,隨著損傷修復過程的發展,GAP-43的量不斷減少,一旦代償的突觸聯系重新建立,GAP-43的量也降到了原來的基礎水平。單靠CNS損傷后自身有限的可塑能力和損傷刺激產生的有限的GAP-43促進神經再生常常不足以完全代替神經損傷,所以一些無法修復代償的損傷造成了后遺癥,那么在臨床上如果能采用一些干預手段促進GAP-43表達量增加和表達時間延長,使得CNS的反應性再生、結構重建能充分修復損傷,這對于CNS損傷的急性期處理、后期康復治療都具有十分重要的意義。1.3與肌動蛋白的配合性生物酶抑制劑Homer蛋白是一種有多個結構域的胞質蛋白,作為支架蛋白,能通過調節蛋白質之間的相互結合而發揮廣泛作用,包括影響發育中的神經元對外界信號作出反應,促進神經元軸突的發芽和延伸。Shiraishi等認為發育小鼠小腦顆粒細胞中表達分泌的Cupidin是一種Homer蛋白家族成員,可激活Rho家族中的GTPase,并與肌動蛋白結合,從而使細胞骨架的有序性發生改變,重新排列,以對周圍環境中或吸引或排斥的因素作出適應性反應。Foa連續攝影觀察了視覺頂蓋細胞的軸突投射、致靶,并比較了不同長度及不同突變點的Homer蛋白對這一過程的影響,提出三種Homer發揮效能的可能機制:①干擾Ca2+的釋放聚集將阻礙突起延伸并改變生長錐對指導信號的反應;②影響生長錐表面的受體分布,阻斷Homer,妨礙生長錐對周圍信號分子的正確識別;③直接調控肌動蛋白的組裝。Homer究竟以何種方式發揮作用還有待深入研究,但可以肯定的是,正確適宜地發揮調節軸突識靶、尋路的作用,需要軸突生長錐中有適宜濃度的Homer,濃度不能太高,也不能太低,并且Homer在時間空間上的分布也要合適。2軸突生長的抑制因素2.1nogo-a和ng-a在細胞內表達治療Nogo蛋白屬Reticulon家族成員,已經鑒定出3個Nogo的cDNA序列分別編碼三種不同的Nogo異構體,即Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C。CNS神經元損傷后,溶解的少突膠質細胞釋放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,與其特異性受體復合物結合,通過第二信使作用于Rho,對生長錐中的微絲進行調節,使生長錐潰變,抑制軸突再生。除上述機制外,Nogo-A還對軸突生長相關基因有下調作用。此抑制作用的細胞內信號轉導機制目前尚不清楚。現在,與Nogo相關的基因和藥物治療將成為CNS損傷后促進軸突再生及抗腫瘤的新的有效手段。目前已有人在構建抗NgR的基因工程單克隆抗體,以阻斷Nogo-66、MAG、OMgp三種因素對軸突再生的抑制,其有效性有待進一步實驗證實。NgR的競爭性拮抗劑-NEP1-40已被成功制備出來,相信在不久的將來,研制出更為全面有效的阻斷劑和轉神經營養因子基因的干細胞一樣,將是促進神經再生的又一熱點。美國加州大學Goldbery和Barree博士對此給予很高的評價,認為Nogo基因的發現是探索脊髓損傷和中風病人治療漫長道路中的一個里程碑。2.2g調控軸突生長MAG是髓鞘的重要組成成分,其參與髓磷脂結間部的形成,通過影響神經纖維的磷酸化過程而抑制軸突發芽,使神經纖維數量穩定在一定水平上。同時,MAG亦調控著軸突生長錐的行為,通過引發生長錐的崩潰而抑制軸突的生長。MAG是導致CNS和PNS神經再生能力差異的重要原因之一。MAG約占中樞髓磷脂蛋白的1%,占外周髓磷脂蛋白的0.1%,PNS髓磷脂中MAG含量只有CNS的1/10,因此PNS髓磷脂對神經再生抑制作用較弱。另外,PNS損傷后,吞噬細胞迅速聚集在損傷部位,髓磷脂碎片清除較快,利于軸突再生。相反,CNS損傷部位吞噬細胞較少,抑制性物質不易清除,軸突再生受到抑制。2.3cspg的調節作用研究表明CSPG主要分布于神經元周圍的基質中,通過置換結合在含多聚賴氨酸底物中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可抑制軸突生長。每個神經元周圍的基質中CSPG含量不同,提示CSPG參與調節神經元微環境的關鍵因素。聚集蛋白聚糖家族(aggrecanfamily)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、神經蛋白聚糖C(neuroglyC)是哺乳動物CNS發育中的3種經典的CSPG。在生理條件下,CSPG的作用可能主要表現為抑制軸突的無序生長和防止神經纖維的異常連接。多數學者認為星形細胞形成的膠質疤痕是中樞抑制因子的重要來源,而CSPG在膠質疤痕中表達上調。Asher的研究中還發現TGFβ和EGF/TGFa可以增加CSPG的表達,而PDGF和IFNγ可減少其表達。也許通過控制這些物質的數量能調節CSPG的表達,從而影響軸突的生長。因此認為,CSPG的抑制作用或許在神經發育過程中保證軸突沿正確方向延伸,消除錯誤分支時發揮過重要功能。這一點也引起了對CSPG在發育中的作用機制的特別關注。最近的研究發現,CSPG對軸突生長的抑制作用由Rho/ROCK通路介導,這為干預CSPG的作用以促進中樞神經的修復提供了新的思路。3暗號at投資/orrepunsing神經系統發育過程中,神經元軸突到達遠距離的靶細胞形成連接是最為關鍵和精細的環節。這種正確的導向主要依賴于周圍環境中的吸引和/或排斥暗號(attractiveand/orrepulsiveguidancecue)。導向暗號主要有netrins、slits、semaphorins和ephrins。導向暗號與相應的膜受體結合,通過Ca2+、cAMP、RhoGTP酶信號通路,活化細胞骨架合成相關蛋白profilin、ENA/WASP和Arp2/3分別調節actin的聚合和逆流,最終引起細胞骨架向正確的方向延伸。3.1工商網絡中有效激活線性小g蛋白,激活回復突變的第三人影響細胞的活性導素(Netrins)是一種分泌蛋白,在神經發育所需的軸突導向及細胞遷移中發揮雙重導向功能——吸引或排斥,其主要依賴于生長錐所表達的不同受體結腸癌缺失蛋白(DCC)或UNC5同源物(UNC5H),從而傳遞不同信息。目前發現在幾乎全部物種中,Netrin蛋白在神經系統高表達,缺乏Netrin導致本應向中線生長的神經軸突方向發生錯誤。Netrin-1是家族中研究最多的分子。Tessier-Lavigne報道生長錐的環核苷酸水平影響其對軸突導向因子的反應性,cAMP/cGMP比例增高激活Netrin-1對軸突產生吸引作用;比例降低則產生排斥作用,這主要是通過調節細胞膜上Ca2+通道開放,改變Ca2+水平而實現的。最近還發現Netrin-1與DCC結合可激活小G蛋白(GTPs)如Rac-1和cdc42,而Rac-1和cdc42則廣泛參與細胞骨架形成并影響細胞活動。另外,由于生長錐富含細胞骨架蛋白,有學者認為軸突導向因子是通過誘發骨架蛋白重建而發揮功能。3.2plusin-b的晶體結構及親水性能信號素(Semaphorins)是一類分泌型跨膜蛋白,可引起軸突的排斥反應。近年來許多實驗表明,膠質瘢痕對Semaphorin的表達分泌關系密切。在神經發育期Semaphorin抑制/排斥軸突生長錐,影響生長錐伸展方向,確保其向靶組織定向生長。Vikis等提出:Neuropilin并不單獨發揮作用,只是Plexin-B的輔助受體。而Plexin-B卻可以單獨或協同Neuropilin起作用,與活化的Rac相互結合,此過程中Plexin-B的胞內結構域CRIB(Cdc42/Rac結合部位)不可或缺。進一步研究發現:Plexin-A3和Plexin-C1沒有此作用,RhoA和Cdc42也不能結合Plexin-B1,說明Plexin-B1和活化的Rac的結合是非常特異的。另外,瘢痕周邊的成纖維細胞分泌的SemaⅢ是否對瘢痕內新生血管的形成以及瘢痕抑制軸突損傷后再生產生影響,與何種受體結合、通過何種信號轉導途徑都是值得進一步探討的問題。3.3slit蛋白和robo基因Slit是由膠質細胞分泌的細胞外基質蛋白,1984年在果蠅胚體首次鑒定出參與決定其幼體角皮顏色的Slit基因,至1999年,發現Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受體,從此對Slit功能的認識才有了突破性的進展。迄今為止,從果蠅至哺乳類動物,已發現了三種Slit和三種Robo基因及其表達產物,并對它們在神經系統發育、損傷和再生中的作用有了初步認識。體外實驗證明,Slit蛋白具有雙重功能,能排斥運動神經元軸突和促進感覺神經纖維的分支和延伸,其排斥和吸引的性質不僅取決于Slit本身和受體Robo,而且與軸突內第二信使的濃度有關。最新的研究表明,slit不僅可排斥軸突的伸展方向,還可逆轉神經元的遷移方向。3.4eph家族蛋白Eph/Ephrin是目前已知的具有最多成員的蛋白受體酪氨酸激酶家族,該亞族的大多數成員主要在神經系統以獨特的重疊模式表達。越來越多的研究表明,Ephrin/Eph不僅調控局部神經元的投射、換元、突觸重塑、功能建立及干細胞的增殖分化遷移都有密切的關系,而且還可以指導生長軸突的尋靶。Drescher和Vanderhaeghen等研究發現Eph受體調節神經纖維投射和精確的解剖定位,若破壞Ephrin-A5基因,在新皮層軀體感覺區域產生混亂的并且投射到前腦感覺纖維缺乏。Eph家族蛋白還影響神經元初始接觸突觸和突觸維持的發育過程。它們激活突觸雙向信號通路,破壞突觸的穩定性而激發突觸的可塑性;通過EphB2與Ephrin-B1相互作用可產生粘附作用,EphB2和Ephrin-B1在突觸的定位很有可能依靠PDZ結合域。Eph/Ephrin參與損傷后的神經再生過程。脊髓外傷后EphB3表達增高,阻滯EphB3后再生增強;EphrinA也抑制軸突生長并影響細胞生存,表明Eph/Ephrin可能是損傷后再生的不利因素。4成立監控細胞的毒中樞膠質細胞不能象外周神經施旺細胞為軸突再生提供理想的條件及化學因子,相反,中樞膠質細胞能產生多種毒素,殺死神經細胞和受損的神經軸突。同時,膠質細胞增生,堆積于損傷處,形成緊密的疤痕結構,阻斷軸突