堿性纖維素酶產生菌的分離和篩選實驗設計方案組員：胡小鵬（學號：2008300118）張麗媚（學號：2008300006）萬程（學號：2008300063）徐云（學號：2008300026）一.實驗目的：掌握無菌操作技術掌握選擇培養基的設計和配制掌握特定菌種篩選方法掌握菌種鑒定方法測定菌種的生長曲線和堿性纖維素酶的活性二.實驗原理：該研究設計性實驗是利用纖維素酶產生菌可以分解纖維素酶，故而在含有羧甲基纖維素的平板(pH9.0)上可形成透明圈的原理分離和篩選堿性纖維素酶產生菌。一.實驗內容:(1)培養基選擇培養基的配制固體培養基：250mL三角瓶---1.8g營養肉湯---100mL水---調pH9.0---2gCMC-Na---2g瓊脂---攪拌均勻--包扎----滅菌液體培養基：250mL三角瓶---1.8g營養肉湯---100mL水---調pH9.0---2gCMC-Na---攪拌均勻--包扎----滅菌(配制2份備用)搖瓶發酵培養基的配制蛋白胨1.0%酵母粉1.0%CMC-Na1.0%NaCL0.5%KH2PO40.1%,另配10%的NaCO3，分開滅菌后與上述培養基成分按1：9的比例混合均勻，使培養基的初始PH為9.5-10(2)配制篩選平板和斜面培養基在超凈臺中將上述培養基倒入平板和試管中，試管傾斜放置，待培養基凝固后，低溫保存，待用。(3)菌種篩選稱取土樣10g,用無菌水稀釋定容至100ml，將土壤液稀釋至 ，移取150ul土壤懸液到篩選平板A,均勻涂布后于30°C恒溫培養箱培養12h,待平板A長出單菌落后，用接種環挑取一個單菌落，在篩選平板B上進行平板畫線操作(詳細方法見實驗書P129-130)，將平板B置于30C恒溫培養箱中培養24h，待平板B上長出單菌落時，用接種環挑取每個單菌落的一半到另一篩選平板C上，作染色鑒定，原來平板B保存于4C的冰箱中，保藏備用將用于染色鑒定的篩選平板C于30C恒溫培養1-2d，向培養皿中加入適量往培養皿中加入適量1mg/mL的剛果紅溶液，染色1h;棄去染液，加入適量1mol/L的NaCl溶液，洗滌1h，若細菌產生纖維素酶，則在菌落的周圍會出現清晰的透明圈，依據透明圈的直徑大小選擇產酶菌株。將純化的產堿性纖維素酶菌株接種到斜面培養，待用。(4)生長曲線的測定流程 種子液一標記一接種一培養一測定種子液制備取大腸桿菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環菌苔，接入肉膏蛋白豚培養液中，靜止培養12h作種子培養液。標記編號取盛有50mL無菌肉膏蛋白豚培養液的250mL三角瓶11個，分別編號為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。接種培養用2mL無菌吸管分別準確吸取2mL種子液加入已編號的11個三角瓶中，于37C下振蕩培養。然后分別按對應時間將三角瓶取出，測OD值生長量測定將未接種的肉膏蛋白豚培養基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調節零點，作為空白對照，并對不同時間培養液從0h起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養基適當稀釋后測定，使其OD值在0.10.?0.65以內，經稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數，才是培養液實際的OD值。結果以上述表格中的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。⑸發酵產酶將經篩選的單菌落由斜面培養基接種到30ml（250ml的三角瓶）搖瓶發酵培養基中，于搖床37°C，225rpm下培養48h，制成液體菌種。然后按1%的接種量將液體菌種加入到50ml（250ml的三角瓶）搖瓶發酵培養基中，在搖床37C，225rpm下進行發酵。取培養適當時間（具體根據生長曲線制定）的發酵液在高速離心機中進行4C，8000rpm離心10min，上清即為粗酶液。（6）酶活性測定（與測生長曲線可以同步進行）標準曲線的繪制（根據實際測定的酶液吸光值，對應該曲線可以查出相應的酶活力）分別吸取0.5%標準葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.omL，分別定容至50mL。再分別吸取上述溶液各1.5mL于比色管中，各加l.5mL3,5一二硝基水楊酸溶液，煮沸5min（另作1管對照，取1.5mL蒸餾水，加1.5mL3，5一二硝基水楊酸溶液，同樣煮沸5min。冷卻后，用分光光度計在540nm波長下比色，以光密度作縱座標，對應標準葡萄糖溶液含糖的毫摩爾數（酶活力）為橫座標，繪制標準曲線。取菌液在8000r/m下離心10分鐘，得到的上清液為酶液。③取0.1ml酶液（另取0.1毫升酶液在沸水浴中煮20分鐘滅活作對照），加入1mlpH=8.04的1%CMC-Na溶液，置于55°C中恒溫反應30分鐘，然后加入1mlDNS,在沸水浴中顯色10分鐘，再加入2毫升水，測540nm吸光度(以滅活的酶液經同樣操作后作為對照)。用葡萄糖做標準液以每小時生成相當于1mg葡萄糖為一個活力單位U。菌種鑒定取篩選平板C的單個菌落，在載玻片上進行革蘭氏染色鑒定觀察。菌種保存無菌甘油制備將適量的60%的甘油置于三角瓶中，外加封口膜，121C，高壓蒸汽滅菌20min后，備用菌懸液的制備將菌