牡丹葉對(duì)不同受體植物幼苗生長(zhǎng)的影響

牡丹是牡丹科的一種落葉灌木。它是重要的觀賞植物和藥物。其根皮為常用中藥材,內(nèi)含的丹皮酚具有抗血栓形成、抗動(dòng)脈硬化、降血壓、保護(hù)腦組織等多種藥理作用。花瓣富含多酚、類(lèi)黃酮與花色苷,具抗氧化活性和自由基清除能力。牡丹籽提取物Ⅱ(脂溶性成分)對(duì)枯草桿菌、沙門(mén)氏菌、根霉菌和黑曲霉菌均有一定的抑制作用。提取物Ⅲ(水溶性成分)對(duì)枯草桿菌、沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌均有一定抑菌作用。葉中所含有的黃酮類(lèi)化合物對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和沙門(mén)氏菌(Salmonella)3種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用。黃酮類(lèi)化合物還具有抗氧化、清除自由基、消炎、調(diào)節(jié)血脂、抗癌、抗HIV等廣泛的生物活性。羅小勇采用瓊脂混粉法測(cè)定了牡丹不同器官粉末對(duì)生菜、黃瓜、反枝莧、苘麻、小麥和稗6種受體植物幼苗生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)除莖器官外,其他各器官的粉末在10g/L的添加濃度下,對(duì)各受體植物幼苗的生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用,且對(duì)胚根或種子根的抑制效果明顯高于對(duì)胚軸或胚芽鞘的抑制。各器官中以根和葉的效果最好,花、果實(shí)和葉柄次之,莖最低。除此之外,尚未見(jiàn)其他有關(guān)牡丹對(duì)植物幼苗具有抑制效應(yīng)的報(bào)道。本研究選擇活性最高的葉器官進(jìn)一步測(cè)定了其粉末在不同濃度下對(duì)生菜、小麥、稗、黃瓜、夏至草、播娘蒿和獨(dú)行菜等7種受體植物幼苗生長(zhǎng)的影響,并探索了其不同溶劑提取物的抑制活性大小,以期為進(jìn)一步開(kāi)展植物源活性物質(zhì)的提取分離及開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。1材料和方法1.1電動(dòng)粉碎機(jī)制備牡丹葉于2011年5月采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。將其置陰涼處干燥后,用電動(dòng)萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW100型,轉(zhuǎn)速24000r/min,天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))粉碎1～2min,取過(guò)40目鐵篩的粉末于低溫冰箱(1℃)中保存?zhèn)溆谩?.2cumeastivuml.生菜(Lactucasativavar.ramosaHort,抗熱綠湖黑核西生菜特選種388,蔡興利國(guó)際有限公司生產(chǎn),美國(guó))、小麥(TriticumaestivumL.,煙農(nóng)24號(hào))、黃瓜(CucumissativusL.,青研85F12)、稗[Echinochloaarusgalli(L.)Beauv.]、夏至草[Lagopsissupine(Steph.)IK.-Gal.exKnorr.]、播娘蒿[DescurainiaSophia(L.)Schur.]和獨(dú)行菜(LepidiumapetalumWilld.)。雜草種子均采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。1.3測(cè)試方法1.3.1水提取液的制備稱(chēng)取30g牡丹葉粉末3份置于3個(gè)500mL三角瓶中,分別加入99.5%甲醇溶液、99.7%乙醇溶液和蒸餾水各300mL,充分搖勻使之全部潤(rùn)濕后置室溫(20℃)下浸提,每隔3h攪拌1次,2d后過(guò)濾,收集濾液。而后按同樣方法再提取2次。合并3次濾液,真空抽濾(Whatman,No2.)后于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得到浸膏。水提取液置于45℃水浴鍋內(nèi)自然風(fēng)干。針對(duì)乙醇溶劑還進(jìn)行了0、20%、40%、60%、80%和100%不同溶劑濃度的提取試驗(yàn)。1.3.2牡丹花葉提取物的處理采用羅小勇提出的瓊脂混粉法進(jìn)行。將受體植物種子經(jīng)0.2%次氯酸鈉溶液浸泡15min后,用自來(lái)水沖洗數(shù)次并置流水下浸泡吸水3～5h(根據(jù)室內(nèi)溫度調(diào)整時(shí)間),而后用蒸餾水洗滌數(shù)次,均勻擺放于帶蓋方盤(pán)內(nèi)的吸水紙上,滴加蒸餾水至種子不漂浮,遮光置于全智能人工氣候箱(HP1000GS-B型,武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司生產(chǎn))內(nèi)發(fā)芽,24～72h后胚根或幼根的長(zhǎng)度將達(dá)到3～5mm。稱(chēng)取0.5g瓊脂粉末分別置于250mL三角瓶?jī)?nèi)后加入94.5～99.5mL蒸餾水(根據(jù)所加樣品的濃度調(diào)整水量),放入微波爐內(nèi)加熱至完全溶解后靜置,待冷卻至60℃時(shí)分別加入事先稱(chēng)好的牡丹葉粉末或不同溶劑提取物,然后分別均勻倒入3個(gè)小塑料杯內(nèi),冷凝,配制成含有不同濃度供試材料的0.5%瓊脂凝膠,以未加供試材料的0.5%瓊脂凝膠為對(duì)照處理。其中,葉粉末的供試濃度梯度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0g/L,牡丹葉提取物的供試濃度梯度分別為0、0.05、0.25、0.5、2.5、5.0g/L。移植時(shí)先用尖嘴鑷子在已凝固的瓊脂表面插5個(gè)小孔,而后分別夾取胚根長(zhǎng)度基本一致的已發(fā)芽指示植物種子,將胚根垂直由小口輕輕植入瓊脂凝膠中。每杯5粒,重復(fù)3次。而后將所有杯子用錫紙封口并置于已消毒的小紙箱內(nèi),為防止光照對(duì)化合物及植物幼根生長(zhǎng)的影響,將小紙箱放入人工氣候箱遮光培養(yǎng)3～4d。人工氣候箱的設(shè)置條件為:14h(25℃)光照和10h(20℃)黑暗的自動(dòng)循環(huán),箱內(nèi)的相對(duì)濕度為60%。待處理結(jié)束后用電子游標(biāo)卡尺分別測(cè)量受體植物幼苗胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的長(zhǎng)度。按下式計(jì)算胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的實(shí)際生長(zhǎng)量,應(yīng)用EXCEL軟件,以生長(zhǎng)量為基數(shù),分別計(jì)算不同濃度的牡丹葉粉末處理之后對(duì)指示植物胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)生長(zhǎng)的抑制率以及樣本的誤差。同時(shí)應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算出有效中濃度(EC50),并以LSD法對(duì)獲得的抑制率進(jìn)行差異顯著性分析。生長(zhǎng)量=處理后的胚根(胚軸)長(zhǎng)-處理前的胚根(胚軸)長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照生長(zhǎng)量-處理生長(zhǎng)量)/對(duì)照生長(zhǎng)量×1002結(jié)果與分析2.1不同濃度的牡丹葉粉末對(duì)七種受體植物幼苗的生長(zhǎng)有影響2.1.1不同供試濃度對(duì)夏至草幼苗胚根和胚軸生長(zhǎng)的影響表1所示為不同濃度牡丹葉粉末對(duì)雙子葉植物幼苗生長(zhǎng)的影響。可見(jiàn),牡丹葉粉末對(duì)所有受體植物胚根和胚軸生長(zhǎng)的抑制率隨著供試濃度的增加而增大,且對(duì)胚根生長(zhǎng)的抑制作用明顯高于對(duì)胚軸的抑制。其中,對(duì)生菜而言,在0.625g/L的最低供試濃度下,幼苗胚根的生長(zhǎng)就已經(jīng)受到一定的抑制,抑制率為29.3%,而對(duì)胚軸的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)胚根/胚軸生長(zhǎng)的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對(duì)二者的抑制率分別達(dá)到69.3%/21.6%、81.6%/31.3%、92.5%/45.7%和96.7%/67.4%,其中,除了兩個(gè)高濃度對(duì)胚根的抑制及兩個(gè)低濃度對(duì)胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為0.93、5.25g/L。但對(duì)黃瓜幼苗胚根和胚軸生長(zhǎng)的影響,0.625g/L的最低供試濃度下影響均不明顯,抑制率分別僅為6.3%和4.8%。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)胚根和胚軸生長(zhǎng)的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對(duì)二者的抑制率分別達(dá)到26.4%和12.9%、33.7%和16.3%、61.9%和23.1%、79.0%和29.0%,其中,對(duì)胚根的抑制除了兩個(gè)低濃度之間差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平,對(duì)胚軸的抑制除3個(gè)高濃度之間、2個(gè)低濃度之間及1.25g/L和2.5g/L兩濃度之間均不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為3.58g/L和>10.0g/L。夏至草幼苗胚根和胚軸的生長(zhǎng)在0.625g/L的最低供試濃度下均受到一定的抑制,抑制率分別為17.7%和14.4%。在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下則分別提高到66.4%和20.3%、85.8%和27.7%、95.1%和47.4%、97.4%和68.3%,其中,除了兩個(gè)高濃度對(duì)胚根的抑制差異不顯著,以及0.625、1.25g/L兩濃度之間對(duì)胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為1.09、5.27g/L。播娘蒿在0.625g/L的最低供試濃度下,其幼苗胚根和胚軸的生長(zhǎng)不但沒(méi)有受到抑制,反而顯示出一定的促進(jìn)作用。但在1.25g/L的供試濃度下,胚根的生長(zhǎng)受到顯著的抑制,抑制率達(dá)67.9%,對(duì)胚軸生長(zhǎng)的影響則較輕微。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)胚根和胚軸生長(zhǎng)的抑制率依次提高,在2.5、5.0、10.0g/L濃度下對(duì)二者的抑制率分別達(dá)到87.3%和8.4%、96.3%和25.3%、97.1%和51.0%,其中,除了兩個(gè)高濃度及兩個(gè)低濃度對(duì)胚根的抑制差異不顯著,以及1.25g/L濃度處理與空白對(duì)照對(duì)胚軸的抑制差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為1.02g/L和9.65g/L。獨(dú)行菜在0.625g/L的最低供試濃度下,只有胚根的生長(zhǎng)受到明顯的抑制,抑制率為31.4%,而胚軸的生長(zhǎng)則受到輕微的促進(jìn)。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)胚根和胚軸生長(zhǎng)的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對(duì)二者的抑制率分別達(dá)到77.2%和9.9%、94.2%和31.9%、96.8%和45.5%、98.7%和55.2%,其中,3個(gè)高濃度下對(duì)胚根的抑制差異不顯著,對(duì)胚軸的抑制差異在2個(gè)高濃度和3個(gè)低濃度下均不顯著,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為0.79g/L和6.84g/L。2.1.2供試濃度對(duì)胚芽劍生以小麥和稗為單子葉受體植物測(cè)定了牡丹葉粉末在不同濃度下對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響,其結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn),與上述雙子葉受體植物一樣,它們的幼苗生長(zhǎng)也受到了顯著的抑制,抑制作用隨供試濃度的增加也明顯提高,且對(duì)種子根的抑制作用明顯高于對(duì)胚芽鞘的抑制。小麥在0.625g/L的最低供試濃度下,只有種子根的生長(zhǎng)受到明顯抑制,抑制率為28.0%。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)胚芽鞘的生長(zhǎng)也顯示出明顯的抑制,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L濃度下對(duì)種子根和胚芽鞘的抑制率分別達(dá)到55.3%和29.1%、74.1%和42.7%、81.2%和52.3%、87.4%和60.8%,除兩個(gè)低濃度對(duì)胚芽鞘的抑制差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為1.20g/L和4.65g/L。稗幼苗種子根和胚芽鞘的生長(zhǎng)在0.625g/L的最低供試濃度下均受到顯著的抑制,抑制率分別為39.0%和20.6%。此后,隨著供試濃度的增加,對(duì)二者生長(zhǎng)的抑制率依次提高,在1.25g/L、2.5g/L、5.0g/L和10.0g/L濃度下抑制率分別達(dá)80.6%和39.4%、88.3%和50.3%、91.2%和56.4%、96.5%和62.6%,除2.5g/L和5.0g/L兩濃度之間對(duì)種子根的抑制差異不顯著外,其余均達(dá)顯著水平。計(jì)算對(duì)二者的EC50分別為0.64g/L和3.36g/L。2.2種溶劑提取物對(duì)生姜幼苗胚根和胚軸的抑制效果表3所示為牡丹葉不同溶劑提取物對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)的影響。可見(jiàn),盡管在低濃度下,各溶劑提取物對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)的影響有所差異,但在高濃度下,均顯示出較高的抑制作用,尤其是乙醇和甲醇提取物。在2.5g/L和5.0g/L濃度下,3種溶劑提取物對(duì)生菜幼苗胚根和胚軸的抑制率,乙醇為94.2%和54.4%、97.2%和69.3%,甲醇為94.5%和49.1%、97.0%和61.3%,蒸餾水為77.2%和11.3%、89.5%和29.3%。計(jì)算EC50分別為0.25g/L和1.56g/L、0.44g/L和2.74g/L、0.82g/L和>5.0g/L。2.3牡丹花葉片提取物對(duì)種子生長(zhǎng)和胚軸抑制率的影響根據(jù)上述結(jié)果,選擇提取物活性最高的乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了不同提取濃度試驗(yàn),其結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn),用20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液處理牡丹葉片粉末所得到的提取物對(duì)生菜幼苗胚根生長(zhǎng)的抑制率均較高,依次為92.5%、97.6%、98.0%、99.1%和97.7%,而對(duì)胚軸的抑制率相對(duì)較低,依次分別為31.2%、47.3%、53.7%、63.5%和69.7%。3不同受體植物幼苗生長(zhǎng)的差異許多研究表明,植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多具有植物化感活性的物質(zhì),當(dāng)這些物質(zhì)通過(guò)淋溶、揮發(fā)、根系分泌或殘株分解進(jìn)入周?chē)h(huán)境后,會(huì)對(duì)其他植物或自身的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。但不同植物間、同一植物的不同器官間化感作用的大小有著較大的差異。牡丹也不例外,各器官在10g/L的處理濃度下,對(duì)生菜、小麥等多種受體植物幼苗的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出較高的抑制活性,即化感活性,且以根和葉的效果最好,這是國(guó)內(nèi)外牡丹對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)具有抑制活性的首次報(bào)道。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步測(cè)定了其葉器官粉末在不同濃度下對(duì)生菜、小麥、黃瓜、稗草、夏至草、播娘蒿和獨(dú)行菜等7種受體植物幼苗生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)不同受體植物的敏感性存在較大差異,呈現(xiàn)出一定的選擇性。其中,以稗的敏感性最強(qiáng),抑制其種子根和胚芽鞘生長(zhǎng)所需的有效中濃度(EC50)分別只有0.64g/L和3.36g/L,而黃瓜的敏感性最低,抑制其幼苗胚根和胚軸生長(zhǎng)所需的EC50分別為3.58g/L和>10.0g/L,其他植物的敏感性則介于稗與黃瓜之間。稗、播娘蒿、獨(dú)行菜、夏至草都是常見(jiàn)的農(nóng)田雜草,其中,稗和播娘蒿更是危害小麥等多種作物的惡性雜草,牡丹葉對(duì)幾種雜草所表現(xiàn)出的高抑制活性說(shuō)明該器官中可能含有可供除草劑開(kāi)發(fā)的活性物質(zhì)。為了進(jìn)一步提取分離這些高活性物質(zhì),本研究以提取物對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)的抑制活性大小為指標(biāo),探索了不同溶劑提取物的抑制效果,發(fā)現(xiàn)乙醇和甲醇提取物對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)的抑制活性高于蒸餾水提取物的抑制效果,而兩種有機(jī)溶劑之間以乙醇的抑制效果較高。因而,選擇乙醇為提取溶劑,進(jìn)一步測(cè)定了其最佳提取濃度,發(fā)現(xiàn)在10.0g/L的供試濃度下,以80%乙醇溶液提取物對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)的抑制活性最高。這些結(jié)果為牡丹葉中活性物質(zhì)的進(jìn)一步提取分離提供了重