無籽西瓜愈傷組織誘導及植株再生研究

無核生瓜比普通二倍體西瓜糖含量高，食用方便，耐貯藏，深受人們喜愛。但其制種復雜,成本高,所得的三倍體無籽西瓜種子中很多胚芽發育不良,子葉畸形,種皮厚,種子發芽率低,苗期生長緩慢,這些因素制約了無籽西瓜的生產。西瓜組織培養始于20世紀70年代,自1979年獲得初步成功以來,國內外相繼報道了這方面的研究進展,但利用無籽西瓜子葉作為外植體獲得再生植株的報道甚少。為此,我們以無籽西瓜子葉為外植體,研究了通過愈傷組織階段誘導芽及獲得再生植株的培養條件。1材料和方法1.1種子離體培養及植株再生試驗選用無籽西瓜品種黑蜜5號為試材,于2002年起在河南農業大學林學園藝學院組培室進行子葉離體培養及植株再生試驗。利用鄭先波等報道的方法獲得無籽西瓜無菌苗。1.2一般培養基配方的選擇和實驗方法1.2.1接種法培養暗傳統種以MS為基本培養基,附加不同濃度的6-BA和NAA,共12個處理,各培養基配方見表1。每處理接種10個外植體為1次重復,設4次重復。將無籽西瓜無菌苗的子葉切成0.5cm×0.5cm的小塊,放入培養皿中,在溫度為(25±2)℃的人工氣候箱內進行暗培養,7天后移到光周期為16小時光照、8小時黑暗,光照強度為2000lx的培養室中繼續培養。28天后觀察并統計愈傷組織及芽的誘導情況。1.2.2光照對無籽西瓜模擬芽誘導的效果研究設光照28天、先黑暗7天再光照21天、先黑暗14天再光照14天、一直在黑暗下28天、先光照7天再黑暗21天5種不同的光周期處理,將芽接種到篩選出的最佳芽誘導培養基中,研究光周期對無籽西瓜子葉外植體芽的誘導情況。1.2.3生根培養基上將在芽誘導培養基上達到一定高度的幼芽從基部切斷,然后接種到不同生根培養基上。生根培養基以1/2MS為基本培養基,蔗糖15g/L,附加不同濃度的IAA和IBA,共7個組合,不同培養基配方見表2。放在培養條件相同的三角瓶中培養,20天后觀察生根情況。2結果與分析2.1-ba和naa對無籽西瓜子葉芽誘導的效果由表1可看出,12種培養基都成功誘導出了愈傷組織,且6-BA2.0～5.0mg/L范圍內愈傷組織的誘導率無明顯差異,而芽的誘導情況則有很大差異,芽誘導率隨6-BA濃度的增加呈上升趨勢,最大誘導率達20.0%。這說明較高濃度的6-BA對無籽西瓜子葉芽的誘導很有效,但并非6-BA的濃度越高對無籽西瓜子葉芽的誘導越有利,研究發現,當6-BA濃度達5.0mg/L時,雖然愈傷組織及芽的誘導率與6-BA3.0mg/L差別不大,但誘導的芽出現明顯的畸形或玻璃化,這與任春梅等的研究結果相似。NAA對無籽西瓜愈傷組織及芽的誘導率則表現出與6-BA相反的趨勢,NAA在0.1～0.3mg/L范圍內芽的誘導率隨其濃度的升高而下降。這說明低濃度NAA促進芽的生長,高濃度則抑制其生長。在與6-BA的組合中NAA都表現在較低濃度(0.1mg/L)誘導效果較好,其中以MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L效果最佳,因此,選擇此培養基作為無籽西瓜子葉芽誘導的最適培養基。2.2誘導愈傷組織的誘導接種后將培養皿一直在光照下培養28天和先光照7天后轉移到黑暗下21天都不能誘導出芽,說明光照抑制了無籽西瓜子葉芽的產生。接種后一直在黑暗中培養28天,愈傷組織誘導率為10.0%,只能形成白色雪花狀的愈傷組織不能形成芽。接種后先置于黑暗中7天或14天再轉移至光照下均能誘導出愈傷組織,從而在愈傷組織上誘導出芽,愈傷組織誘導率分別為30.0%、27.5%,芽誘導率分別為12.5%、10.0%。此結果說明無籽西瓜芽的誘導和愈傷組織的誘導一樣都需要在黑暗條件下啟動,進一步的生長分化則需要在光照下進行。2.3不同濃度對植物葉片生根性能的影響由表2可看出,無籽西瓜子葉誘導的幼芽生根相對較容易,健壯的芽可以在不含任何生根調節物質的1/2MS中生根,生根率達37.5%,在加入不同濃度IAA和IBA后,生根效果明顯提高。IBA和IAA的濃度在0.1～0.6mg/L范圍內,生根率隨著生長調節物質濃度的升高而增加,最高生根率在90%以上,平均根數也隨之增加,且形成的根生長旺盛,無愈傷組織產生,須根多。因此,可選用1/2MS+IAA0.4mg/L和1/2MS+IBA0.3mg/L為理想的生根培養基。3-ba和naa對5號愈傷組織誘導芽的影響(1)以往的研究表明,6-BA是子葉外植體芽誘導效果最好的生長調節物質,其有效濃度因品種而有所差異,低濃度6-BA(1.0～3.0mg/L)對芽的誘導有良好的促進作用,較高濃度(高于3.0mg/L)則對芽的分化有抑制作用,且再生芽多畸形,難以發育成正常植株。我們研究發現,6-BA在無籽西瓜芽的誘導過程中,起著非常重要的作用,但在較低濃度下(低于2.5mg/L)不能誘導芽的產生,只有在其濃度達到2.5mg/L時才有芽的出現,最適濃度為3.0mg/L,當濃度達5.0mg/L時芽出現畸形及玻璃化。6-BA與其他生長調節物質的組合使用的效果因品種不同而有很大差異。牛愛國等用6-BA與IBA組合以無籽西瓜頂芽為外植體誘導了再生植株。我們則用6-BA與NAA組合從子葉外植體上成功地進行了芽的誘導,并研究發現,以無籽西瓜黑蜜5號子葉為外植體,通過愈傷組織誘導芽的最佳培養基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L。(2)研究發現,無籽西瓜接種后直接進行光處理,抑制愈傷組織及芽的形成,接種后一直進行黑暗處理也不利于芽的產生,只能生成雪花狀的愈傷組織,接種后先在黑暗條件下處理再在光照條件下處理才能誘導芽的產生。此結果表明,無籽西瓜芽的產生首先需要黑暗條件的啟動,其進一步的生長分化則須在光照下進行。此結果也進一步證實了鄭先波等在黑蜜5號愈傷組織誘導上的研究結果。(3)研究發現,無籽西瓜的幼芽生根相對比較容易,IBA和IAA都能很好