2023/9/131毒理基因組學與系統毒理學

公共衛生學院預防醫學系2023/7/301毒理基因組學與系統毒理學公共衛生學院預2023/9/132(一)基本概念基因（gene）,具有遺傳效應的DNA片斷。

基因組（genome），又稱染色體組,指配子中所包含的染色體或基因的總和

一個物種單倍體的染色體數目，物種全部遺傳信息的總和基因組學（genomics）：1986年提出，已經發展成為遺傳學中最重要的分支學科。對物種的所有基因進行定位、作圖、測序和功能分析一、概述2023/7/302(一)基本概念一、概述2023/9/133基因組學研究的最終目標獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關系闡明基因組的進化規律

2023/7/303基因組學研究的最終目標獲得生物體全部基2023/9/134基因組學的研究內容結構基因組學(基因定位、基因組作圖、測序)

功能基因組學又稱后基因組學（postgenomics)包括：基因的識別、鑒定、克隆基因結構、功能及其相互關系基因表達調控的研究蛋白質組學:鑒定蛋白質的產生過程、結構、功能和相互作用方式2023/7/304基因組學的研究內容結構基因組學(基因定2023/9/135（二）人類基因組計劃（HGP）1990，美國NIH和能源部投資＄30億，啟動了人類基因組計劃，預計15年時間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜修訂版2002，完成測序工作二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成2023/7/305（二）人類基因組計劃（HGP）1990，2023/9/136人類基因組草圖基本信息:由31.65億bp組成含3-3.5萬基因與蛋白質合成有關的基因占2%人類基因組人類蛋白質61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源2023/7/306人類基因組草圖基本信息:由31.65億bCREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!CREDIT:JOESUTLIFFScience,V2023/9/138人類基因組計劃（HGP）于2003年4月宣告結束及多種模型生物DNA序列測定的完成，生命科學研究進入了一個全新的認識領域。組學技術（-omics）引人注目，產生了基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、酶組學等，其他生物分子如脂類、糖類、脂蛋白等，也將會成為組學研究的對象。

環境基因組計劃（EnvironmentalGenomeProject，EGP）：加速了環境應激的基因多態性研究。

二、毒理基因組學（toxicogenomics）2023/7/308人類基因組計劃（HGP）于202023/9/1391、毒理基因組學(toxicogenomics)

研究生物體的整個基因組如何對環境有害因素發生反應的一門新興學科。研究基因組與化學毒物間的交互作用及其方式的學科。20世紀90年代后期得到不斷發展，研究組織細胞特定基因的功能并預測受試物毒性。目前毒理基因組學：研究不僅包括基因組水平的效應，也包括RNA的表達（轉錄組學）、蛋白產物表達（蛋白質組學）、代謝組學、遺傳多態性以及生物信息學等相關領域。2023/7/3091、毒理基因組學(toxicogeno2023/9/1310利用人類基因組的資料，幫助篩選和鑒別潛在的環境毒物，并在基因組水平上闡明毒作用發生的機制。近期目標：是確定某種有害因素的反應基因（信號基因）用于毒理學和相關疾病的研究。

遠期目標：建立全基因組與蛋白質組毒性反應知識庫，并在此基礎上開辟以芯片技術和生物信息技術為特征的數字毒理學（digitizedtoxicology）。§2毒理基因組學基本任務、研究目標2023/7/3010利用人類基因組的資料，幫助2023/9/1311

毒理基因組學為從傳統的遺傳毒性檢測方法到基因集群檢測方法的轉變提供了可能，同時將顯著提高遺傳損傷的檢測水平和降低檢測的閾值。如微陣列技術的應用等，理論上該項技術有可能檢測一種特定的化學物對全部人類基因組的效應。突破了傳統毒理學實驗中“一個化學物，一個基因”的方法，提高了效率。2023/7/3011毒理基因組學為從傳統2023/9/1312

美國環境衛生科學研究所（NIEHS）于2000年成立國家毒物基因組學中心（NCT）。主要目標：①促進基因和蛋白質表達技術的應用；②闡明環境暴露與人類疾病易感性間的關系；③識別疾病相關的和毒物暴露的生物學標志；④改進定量方法以闡明暴露水平和暴露—反應間的生物學因果關系；⑤建立毒物在生物系統中環境效應的公共數據庫。2023/7/3012美國環境衛生科學2023/9/13132023/7/30132023/9/1314毒理基因組學為毒性或致癌性評價發展新的、可提供更多信息的試驗系統。為對藥物或其它外源化學物的易感性或反應差異闡明遺傳學基礎。發展生物學標志用于暴露定量。4闡明疾病或毒效應的機制和途徑。發展用于人群研究的工具和資源。

OldenK,20022023/7/3014毒理基因組學為毒性或致癌性評價發展新的2023/9/1315毒理基因組學面臨的基本挑戰：一是如何獲取大規模的生物學數據（基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組的表達數據）：高通量篩選系統提供了可能。二是如何對高通量篩選所得到的大量信息進行及時而合理的處理。如：既有基因表達的數據，還有經典毒理學的試驗資料等

第二節毒理基因組學研究的技術平臺2023/7/3015毒理基因組學面臨的基本挑戰：第二節2023/9/1316美國國家毒物基因組學中心（NCT）研究策略↓↓cDNA→異常值→關系→Northern微陣列分析§分析RT-PCR

證實毒物基因組學分析功能分析↓↓化學物特異性暴露蛋白質組（時間/劑量）譜組織表達↓↓組織表達結合原位細胞蛋白質組分析表達└────┬────┘進入數據庫2023/7/3016美國國家毒物基因組學中心（NCT）研究2023/9/1317一、基因組學與轉錄組學技術平臺（一）差異顯示反轉錄PCR技術（DDRT-PCR)

以PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎。PCR技術的原理：以DNA的一條鏈為模板，在有RNA引物、4種脫氧核苷酸（dNTP）時，和DNA聚合酶的條件下，在引物所結合的位置向3’方向合成新的互補鏈。其反應以雙鏈DNA的變性、退火、延伸為一個循環。經過多次循環（25~30次），便目標DNA片段得以大量擴增。由于每一次循環所產生的新鏈均可成為新的模板用于下一輪循環，故PCR產物以指數方式增加。2023/7/3017一、基因組學與轉錄組學技術平臺（一）差2023/9/1318PCR步驟：（1）高溫變性，雙鏈DNA變性（90～95℃）成為單鏈DNA；（2）低溫退火（37-60℃），引物與單鏈DNA互補序列結合；（3）適溫延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃）使引物延伸。

2023/7/3018PCR步驟：（1）高溫變性，雙鏈DNA2023/9/1319溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環1循環2循環3PCR反應的溫度循環周期PCR反應的每一個溫度循環周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。2023/7/3019溫度（℃）時間（min）9494℃變性2023/9/1320差異顯示反轉錄PCR（

DDRT-PCR）原理：

用3’-端錨定引物和反轉錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉錄第一鏈為模板進行PCR擴增（DDRT-PCR），在標準的序列膠中電泳2~3小時，可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶。2023/7/3020差異顯示反轉錄PCR（DDRT-PC2023/9/1321基本過程：1.從一對處于不同發育階段（或不同基因型）的細胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機引物和3’-端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標記的dNTP的條件下，以第一步反轉錄產物作模板進行PCR擴增。3.將擴增樣品在變性的DNA測序膠中進行電泳分離；2023/7/3021基本過程：2023/9/13224.將有關的差別表達的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進行二次擴增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆。2023/7/30224.將有關的差別表達的DNA條帶從測序2023/9/1323優點：

1.可以同時比較多個樣品表達的差異；

2.可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；

3.檢測靈敏度高，所需樣品少，經PCR擴增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；

4.結合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術，使本方法顯得較單方便。2023/7/3023優點：2023/9/1324局限性：

1.假陽性比例高（50%～75%）；

同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；

mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針。

2.擴增的差別條帶分子長度比較短小（110～450bp）；

2023/7/3024局限性：2023/9/1325（二）基因表達序列分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）

SAGE的主要理論依據：來自cDNA3’端特定位置的一端9-11bp長的序列能夠區分基因組中95%的基因。這一段基因特異的序列被稱為標簽（SAGtag）2023/7/3025（二）基因表達序列分析（serial2023/9/1326SAGE的原理：一是一個9-10個堿基的短核苷酸序列標簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認一種轉錄物。例如，一個9個堿基序列能夠分辨262144個不同的轉錄物（49），而人類基因組估計僅能編碼80000種轉錄物，所以理論上每一個9個堿基標簽能夠代表一種轉錄物的特征序列。二是如果能將9個堿基的標簽集中于一個克隆中進行測序，并將得到的短序列核苷酸序列以連續的數據形式輸入計算機中進行處理，就能對數以千計的mRNA轉錄物進行分析。2023/7/3026SAGE的原理：2023/9/1327用cDNA制備SAGE標簽----將標簽串聯-----再進行測定：可以顯示SAGE所代表的基因在特定組織中是否表達，根據各SAGE標簽所出現的頻率可作為其所代表的基因表達豐度。2023/7/3027用cDNA制備SAGE標簽----將標2023/9/1328但是SAGE只能分離特定時空下表達的基因，且不能分析基因內和基因間的調控序列，克隆出的新基因的功能也有待鑒定。1.SAGE能快速全范圍提取細胞內基因表達信息，并對已知基因進行量化分析。2.能分離克隆新基因。3.定量比較不同狀態下的組織細胞特異基因的表達。4.構建染色體表達圖譜。2023/7/3028但是SAGE只能分離特定2023/9/1329

應用SAGE技術的一個前提條件是GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列信息，尤其是表達序列標簽的序列資料。2023/7/3029應用SAGE技術的一個2023/9/1330微陣列技術（microarrytechnology）一種研究有多少基因能相互作用以及一個細胞網如何同時控制大量基因的新方法。利用機械手精確地將大量DNA分別點到載玻片上。研究者然后從他們研究的細胞中提取的DNA標上熒光標記。標記探針能與載玻片上的DNA互補連接。將載玻片放入掃描儀下，測量每個熒光點的亮度，亮度反映了特定DNA片段存在的量。（三）微陣列分析2023/7/3030微陣列技術（microarrytec2023/9/1331生物芯片的概念：是指能夠快速并行處理多個樣品并對其所包含的各種生物信息進行解剖的微型器件，它的加工運用了微電子工業和微機電系統加工中所采用的一些方法，只是由于其所處理和分析的對象是生物樣品，所以叫生物芯片(Biochip)。

高通量，平行化，微量化的分析手段。

人類和小鼠的全基因組芯片。2023/7/3031生物芯片的概念：是指能夠快速并行處理2023/9/1332生物芯片的分類基因芯片

cDNA芯片Oligo芯片

信息生物芯片

蛋白芯片

生物芯片

微流體芯片功能生物芯片

芯片實驗室

組織芯片（微陣列芯片）（微流控芯片）2023/7/3032生物芯片的分類基因芯片2023/9/1333DNA微陣列（microarryassay）或DNA芯片（DNAchip）技術是新近發展的分子生物學研究工具。基本硬件：基因微陣列或基因芯片，其上含有成千上萬個寡聚核甘酸片段或cDNA探針（cDNA、EST或基因特異的寡核甘酸）。將探針按一定順序以矩陣方式排列在載玻片大小的塑料或玻璃板上。2023/7/3033DNA微陣列（microarryas2023/9/1334通常采用發紅色熒光的Cy3和發綠色熒光的Cy5熒光色素，分別標記實驗和對照樣品中的RNAs.熒光強度和RNAs的含量間有一定關系，通過兩種熒光的相對強度變化來確定實驗組樣品中DNA表達的差異。如：樣品中RNA多于對照樣品時，熒光呈紅色，反之為綠色。

兩樣品RNA含量相等時，呈黃色熒光。如能結合實時PCR，就可得基因的定量表達信息。

DNA微陣列分析靈敏度高，成本也高2023/7/3034通常采用發紅色熒光的Cy3和發綠色熒光2023/9/1335cDNAclones(target)PCRproductamplificationpurificationprintingmicroarrayHybridisetargettomicroarraymRNAprobe)excitationlaser1laser2emissionscanninganalysisoverlayimagesandnormalise0.1nl/spot2023/7/3035cDNAclonesPCRprod2023/9/1336(四)RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技術RNAi是一種基因功能研究的新方法，能快速有效地沉默靶基因的表達，從反向角度闡明基因的功能。是指將外源性雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)導入細胞后，產生21-23nt長度的小分子干涉RNA，引起與其序列同源的特異基因mRNA降解的現象，屬于轉錄后的基因沉默。2023/7/3036(四)RNA干涉（RNAinte2023/9/1337四個重要特征:1)RNAi屬于轉錄后水平的基因沉默機制;2)具有高度的序列特異性;3)具有抑制基因表達的高效性,可以引起該基因缺失突變的表型;而且遠遠少于內源mRNA數量的dsRNA就可以實現完全的抑制效應,即其發生過程中存在著正反饋的信號放大效應;4)RNAi的效應可以在不同細胞間長距離傳遞和維持,而且在某些生物中(比如線蟲)具有遺傳性。2023/7/3037四個重要特征:2023/9/1338RNAi技術主要包括siRNA的設計、合成、向細胞內的導入和沉默效果的檢測四個步驟。

RNAi實驗的五個步驟：1）選取目的基因2）設計相應的siRNA序列3）制備siRNA：化學合成法、體外轉錄合成法、雞尾酒法4）siRNA轉染哺乳動物細胞：脂質體轉染、微注射或電穿孔法5）RNAi效果分析：可從mRNA和蛋白質兩個水平評價2023/7/3038RNAi技術主要包括siRNA的設計、2023/9/1339基因功能研究：通過RNAi特異性抑制基因的表達來闡明基因在生物體中的特定功能。基因治療：利用RNAi技術還可以抑制病毒在感染細胞中的復制增殖，達到治療病毒相關疾病的功效。目前已在病毒性肝炎病毒、HIV等病毒的RNA干涉治療嘗試取得了良好效果。癌癥治療：RNAi技術還給癌癥治療帶來了希望。RNAi技術也適用于基因異常表達導致的遺傳病以及其它疾病的基因治療RNAi技術的應用：2023/7/3039基因功能研究：通過RNAi特異性抑制2023/9/1340（五）單核苷酸多態性檢測（SNPs）單核苷酸多態性：是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，人群中發生頻率大于1%。有單堿基的轉換、顛換、插入、缺失等形式。25%發生于GpG位點，發生C-T轉換。SNP：是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態。2023/7/3040（五）單核苷酸多態性檢測（SNPs）2023/9/1341

人類99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產生的，它構成了不同個體的遺傳基礎。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質上的區別。

2023/7/3041人類99．9％的基因密碼是相同2023/9/1342蛋白質組與基因組相比蛋白質組具有多樣性和可變性。對一個機體而言,基因的數目是恒定的,而蛋白質的種類和數目在同一個機體的不同細胞中各不相同,即使同一細胞在不同的時期（不同的分化程度或不同細胞周期）,不同條件（不同的外源性或內源性刺激）下,其蛋白質表達也不同。雖然可以通過cDNA芯片等方法顯示生物體的基因啟動狀況,但mRNA水平(包括mRNA的種類和含量)并不能完全反映出蛋白質的表達。2023/7/3042蛋白質組與基因組相比蛋白質組具有多樣性2023/9/1343二、蛋白質組學（proteomics）技術平臺鑒定蛋白質的產生過程、結構、功能和相互作用方式目前常用技術路線是利用雙向凝膠電泳分離蛋白、綜合質譜和生物信息學分析技術進行鑒定。目前蛋白質組學研究的核心技術是：雙向凝膠電泳和質譜技術2023/7/3043二、蛋白質組學（proteomics）2023/9/1344（一）雙向凝膠電泳（2-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）原理：細胞抽提物在電泳過程中，依據蛋白質所帶電荷及分子大小而被分離。樣本制備的基本目的：盡可能使樣品轉變為適合進行等電聚焦的狀態，同時保持原有的電荷和等電點。電泳時，使用窄pH及極窄pH范圍梯度凝膠可提高2-DE的分辨率，尤其適用于低豐度蛋白的檢測。還可采用膠上差示電泳（DIGE）。2023/7/3044（一）雙向凝膠電泳（2-dimensi2023/9/13452D-蛋白質電泳2023/7/30452D-2023/9/1346蛋白質組學研究步驟2023/7/3046蛋白質組學2023/9/1347二維凝膠電泳分離蛋白質的方法具有一定局限性：①所得的結果在蛋白質的實際身份和起源基因或基因之間不能建立聯系。②對于一些表達量低,但在細胞中起重要作用的蛋白,以及溶解度極大,極小或極端的蛋白PI值,不能很好的分離。③分離的蛋白點不一定只代表一種蛋白質。據報道,通過此方法分離的真核組織的蛋白點有20%～40%的點包括了至少兩種或兩種以上的蛋白質。蛋白質富集的變化與mRNA的變化間只有中等程度的相關性(r=0.61),而且蛋白質磷酸化與mRNA也沒有特定關系。因此在功能基因組學研究中，mRNA微陣列和二維凝膠電泳/質譜技術是相互補充的。

2023/7/3047二維凝膠電泳分離蛋白質的方法具有一定局2023/9/1348代謝組學MetabonomicsNicholsonJK等（1999）提出代謝組學概念。以NMR技術分析體液中代謝物的“整體模式/指紋”，可以無損傷地觀察動物的生理生化狀態，動態評價藥物毒性效應。與毒物基因組學/蛋白組學技術相結合，代謝組學可以從基因型到表型完整地評價藥物的毒性。NicholsonJK，etal.Xenobiotic1999,29(11):1181-11892023/7/3048代謝組學MetabonomicsNic2023/9/1349代謝組學技術平臺（一）磁共振（NMR）可在一次單獨的檢測中獲得生物體液中成百上千的代謝物組分的信息，不需預先確定被檢測物質的性質。所需樣品量較少、不需復雜的樣品處理或衍生措施，且樣品還可回收用于其它分析。

NMR可分為氫譜（HNMR）和碳譜（CNMR）(二)色譜-質譜聯用技術氣相色譜、高效液相色譜和質譜及其聯用技術因分離特性和靈敏度較好，已在代謝組學研究中廣泛應用。毛細管電泳（CE）和質譜聯用是代謝組學分析的新方向。2023/7/3049代謝組學技術平臺（一）磁共振（NMR）2023/9/1350第三節毒理基因組學研究內容及其應用一）毒作用機制研究二）化學物毒性預測三）比較毒理學研究四）混合物聯合毒作用研究五）危險度評定六）表型錨定七）信息整合2023/7/3050第三節毒理基因組學研究內容及其應用2023/9/1351表型錨定毒理基因組學的一個主要內容，是將特定的基因圖譜改變與特定劑量或時間條件下的毒性損害相聯系的過程。2023/7/3051表型錨定毒理基因組學的一個主要內容，是2023/9/1352毒物基因組學將促進：

機制毒