高效液相色譜法同時測定米糠中4種水溶性維生素

其中之一是一個才華橫溢的開發潛力資源。它含有64%的大米養分和90%的人體所需的各種養分，包括維生素、氨基酸、脂肪酸和其他礦物。米草糖是一種具有良好的生理功能的活性物質，如棕櫚糖、28碳烷醇和神經酰胺。其中水溶性維生素是一類重要的營養成分,在各種保健品、功能型飲料中得到應用。煙酸和煙酰胺能夠促進頭皮血液循環,防止脫發;VB6具有美發功效;VB1具有滋養與深層清潔的作用,因此化妝品中也常添加微量的維生素。淘米水中也含有維生素,用淘米水潔膚洗發,刺激性小,有潤膚護發功效。因此,測定米糠和淘米水中的維生素含量很有必要。測定維生素的方法有紫外分光光度法、熒光法和高效液相色譜法(HPLC)。但HPLC技術用于米糠中水溶性維生素的測定還未見報道。本文采用HPLC建立了米糠及淘米水中的水溶性維生素的測定方法,對樣品前處理方法進行了研究,對測定體系各影響因素進行了優化。該方法簡便快速,準確可靠,對復雜體系中水溶性維生素的測定具有重要的參考價值。1實驗部分1.1化學試劑與試劑Waters505高效液相色譜儀(包括2487紫外檢測器),Empower色譜工作站。色譜柱:HypersilC18(250cm×4.6mmid,5.0μm)。超聲波振蕩器(BRANSONSB3200-T,上海);固相萃取柱(固相PT-系列,河北省津楊濾材廠)等。VB6(純度≥99%)、煙酰胺(純度≥99%)、煙酸(純度≥99.5%)、VB1(純度≥98%)。均購自國藥集團化學試劑有限公司(上海);甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑為分析純。米糠樣品來源于無錫秦良商貿有限公司。糯米樣品產地:云南西雙版納自治州。1.2流動相mmid色譜柱:HypersilC18柱(250cm×4.6mmid,5.0μm),流動相:A:0.1%磷酸水溶液,B:甲醇,以體積比A∶B=88∶12等度洗脫;流速為0.6mL/min。檢測波長266nm,進樣量20μL。1.3樣品溶液的制備1.3.1標準儲備液的制備精確稱取約0.05g的4種維生素標準品,用0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋到50mL,搖勻,分別得到1.36×10-3、1.18×10-3、1.04×10-3g/mL和1.00×10-3g/mL的VB1、VB6、煙酸和煙酰胺的標準儲備液,于4℃冰箱中保存。儲備液用流動相稀釋得所需濃度的標準溶液。1.3.2超聲提取液乙醇-0.1mol/l鹽酸溶液取10.00g米糠于100mL錐形瓶中,加入20mL混合溶劑(體積比為80∶20的甲醇-0.01mol/L鹽酸溶液)超聲提取30min,過濾,濾渣用相同的條件重復提取兩次,合并提取液。用旋轉蒸發儀蒸發濃縮,濃縮液用無水乙醚萃取兩次脫脂,水相經0.45μm濾膜過濾,再過固相萃取柱,定容至10mL容量瓶中,即得米糠供試品溶液。1.3.3洗米水的定容取100g云南產糯米加100mL自來水攪拌20min,瀝出洗米水,然后定容至100mL。過濾,將濾液在12000r/min下離心15min,取上清液,經0.45μm濾膜過濾,再過固相萃取柱,即得淘米水供試品溶液。2結果與討論2.1米糠中蛋白質的分離純化米糠的主要成分有蛋白質、脂肪酸、膽甾醇、多糖等。雖然VB1、VB6、煙酸和煙酰胺都是水溶性物質,但采用水為提取劑,蛋白質、碳水化合物也會隨之被提取出來,干擾測定并污染色譜柱。嘗試了純甲醇以及90%甲醇和10%的0.01mol/L鹽酸水溶液提取維生素,發現不能將水溶性維生素提取完全;70%的甲醇和30%的0.01mol/L鹽酸水溶液雖能將水溶性維生素提取完全,但米糠中的蛋白質也會隨之被提取出來;用80%甲醇和20%0.01mol/L鹽酸水溶液提取,蛋白質會變性產生沉淀,碳水化合物也不溶,而VB1、VB6、煙酸和煙酰胺又有較好的溶解度。因此實驗采用80%甲醇的酸性水溶液提取3次,濃縮,脫脂,再過固相萃取柱去除殘余的干擾物質。糯米淘米水中也含有大量的蛋白質、脂肪酸、多糖等,嘗試了用等體積的10%的三氯乙酸去蛋白,由于酸性太強,體系不穩定;用sevag法去蛋白,需要多次重復,才能較徹底地去除蛋白,比較耗時;而用高轉速離心機將蛋白離心下來,分離效果良好。再過固相萃取柱以去除殘余的干擾物質,可以避免污染色譜柱。2.2流動相和甲醇配比對米糠維生素分離效果的影響文獻中測定B族維生素大多采用在流動相中加KH2PO4調節酸度或加磺酸鹽等離子對試劑抑制分析物的極性,但加鹽后會對高效液相色譜儀的泵頭產生一定的損傷;還有一些報道采用的是耐水色譜柱,采用全水體系做流動相,但耐水色譜柱價格昂貴。本實驗采用普通的C18色譜柱,在流動相中加入稀酸調節酸度,對B族維生素進行測定。實驗中首先嘗試流動相為0.6%醋酸水溶液-甲醇(體積比為88∶12)等度洗脫,對4種水溶性維生素進行分離,發現煙酸和VB6在此條件下不能分開。也嘗試了0.05%三氟乙酸-甲醇體系,4種維生素同樣無法得到分離。將流動相中的水相改換為磷酸水溶液,調整磷酸濃度來實現4種水溶性維生素的分離。實驗中嘗試了0.08%,0.10%,0.12%的磷酸水溶液進行實驗。采用0.08%磷酸水溶液時,4種維生素混合標準溶液得到了較好的分離。但是米糠實際樣品測定時,發現VB1、VB6與相鄰未知物質的峰未達到完全分離。改用0.1%磷酸水溶液,米糠樣品中的待測維生素分離的較好;換用0.12%磷酸水溶液時,效果與0.1%磷酸水溶液相當。但酸性加大會對柱子有一定的傷害,綜合各種因素,選用0.1%磷酸水溶液甲醇體系,以體積比為88∶12等度洗脫?？疾炝?.1%磷酸水溶液與甲醇不同配比時對4種維生素分離的影響,發現流動相中水相比例降到85%時4種維生素無法達到分離,水相比例為88%時,4種維生素在8min內達到基線分離。在上述優化色譜條件下得到4種維生素的標樣圖,見圖1。2.3方法學評價2.3.1方法的重現性取4種維生素的標準儲備液等體積混和,然后稀釋16倍,在上述優化實驗條件下連續5次進樣,測得其峰面積及保留時間的相對標準偏差(RSD)均小于2%,結果表明其重現性較好,如表1所示。2.3.2線性范圍和檢限配置了一系列不同濃度的VB1、VB6、煙酸和煙酰胺的混合標準溶液,在優化的實驗條件下,進行了測定,得出各組分的線性回歸方程、線性范圍,并以3倍信噪比得到檢測限,結果如表2所示。結果顯示線性范圍寬,檢測限低。2.4米糠和7m/7m糠樣品測定結果按1.3.2和1.3.3方法處理好樣品,在優化好的色譜條件下,進行測定。米糠樣品的色譜圖見圖2;米糠及淘米水中維生素測定結果見表3。取米糠供試液做加標回收試驗。結果見表4?；厥章试?6.0%~99.9%,結果可靠。3文酸法提取民法中的可溶性維生素采用80%甲醇的0.01mol/L鹽酸溶液超聲提取,石油醚脫脂,并經固相萃取柱除去雜質,對米糠和淘