劈離式肝移植技術的動物模型建立

0腹肝神經技術的應用由于肝臟來源不足，臨床發展呈現出縮短肝臟移植的趨勢。劈離肝移植就是將一個尸體或活體供肝分割成兩半,分別移植給兩個受體或切取半肝移植給另一受者,既“一肝二受”。這種技術在不損害成人供肝庫的前提下,對供肝的緊缺有一定的緩解作用,具有顯著的優點,但也存在著術后膽道并發癥發生率高、左內側葉缺血壞死等問題,為了進一步開展劈離式肝臟移植的研究,需要找到一種適宜的動物,建立穩定的實驗及麻醉模型。本院建立了劈離式豬肝臟移植及麻醉模型,沿Taira線劈離(膈面位置從肝中靜脈右緣至膽囊床中點,臟面位置從膽囊床中點出發與門靜脈旁正中支近乎平行的直線構成的平面),本文對移植技術及麻醉處理進行探討。1肝移植組織轉流設計:以豬為對象的實驗研究。時間及地點:實驗于2007-06/2009-10在鄭州大學動物實驗中心完成。材料:40只健康良種幼豬,雌雄不拘,體質量25～30kg,受體組20只,供體組10只(供體劈離后一肝二用),剩余10只為供血組。隨機配成20對,每對以體質量重者為供體,輕者為受體,建立豬劈離式原位肝移植模型。實驗方法:術前準備:術前實驗豬禁食12h,禁飲6h。麻醉:肌注氯胺酮15～20mg/kg,阿托品0.02mg/kg,基礎麻醉成功后,開放耳緣靜脈,以2.5%硫賁妥鈉10～15mg/kg靜脈誘導后氣管插管,機控呼吸,術中以2%普魯卡因+0.4mL(40mg)琥珀膽堿復合液靜脈滴注,氯胺酮、芬太尼分次靜脈注射維持麻醉。右頸內靜脈切開置管監測中心靜脈壓,右頸內動脈切開置管監測動脈壓。于切肝前10min、阻斷后10min、供肝插入開放門靜脈后30min取門靜脈血,測電解質、全血緩沖堿及標準碳酸氫根,并應用碳酸氫鈉等維持血液pH值在正常上限及K+在正常下限,并提前靜脈注射葡萄糖酸鈣。溫控溫度計監測鼻咽部溫度。劈離式原位肝移植模型及體外轉流建立:(1)供體全身肝素化(3mg/kg)后,行腹主動脈插管,門靜脈插管。腹腔動脈上方阻斷腹主動脈,以4℃UW液經腹主動脈(1500mL)及門靜脈(2000mL)向肝臟行重力灌注,速度為連續滴注但不成線,開始灌注后即剪開膈肌剪斷胸腔內肝上下腔靜脈,并剪斷肝下下腔靜脈,肝周冰屑降溫,灌洗完畢后見肝臟呈黃白色。于肝十二指腸韌帶向腹腔動脈方向游離肝固有動脈,結扎各動脈分支,直至腹主動脈,于腹腔動脈根部的腹主動脈兩側離斷。完全離斷肝周韌帶,移出供肝,立即置于4℃UW液中。在水浴中沿Taita線行劈離手術,結扎并離斷相應的血管蒂和膽道。仔細檢查肝斷面,發現滲漏處及時縫閉。供肝準備完成前在肝臟的斷面涂以纖維蛋白膠。(2)受體先行脾切除術,全身肝素化(3mg/kg)后,預置并連接脾靜脈、股靜脈和頸外靜脈轉流管,接離心泵,轉流方式為將門靜脈(脾靜脈)和股靜脈血流轉至頸外靜脈。轉流開始,流量20～30mL/kg,同時阻斷肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈及肝十二指腸韌帶,保留足夠長度肝上、肝下下腔靜脈,門靜脈及膽總管切斷取出肝臟,將供肝半肝(左或右)植入,肝周冰屑降溫,右半肝供肝肝上下腔與受體肝上下腔靜脈行端端吻合,吻合時間15～20min,供肝肝下下腔靜脈與受體肝下下腔靜脈行端端吻合,供肝門靜脈與受肝門靜脈行端端吻合,吻合時間10～15min;左半肝肝左與肝中靜脈匯合成一支后,與受體下腔靜脈行端側吻合,門靜脈左支與受體門靜脈行端端吻合術,成功后,停止轉流,開放肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈,開放門靜脈循環,熱缺血時間為0min,冷缺血時間為(30.0±4.0)min。游離受體脾動脈,于結腸后與供體肝動脈端端吻合,重建動脈血供,膽總管行端端吻合。主要觀察指標:觀察不同時期受體心律、平均動脈壓、中心靜脈壓的變化,監測酸堿平衡、電解質和體溫。統計學分析:應用SPSS17.0軟件進行統計分析,結果用＿x±s表示,采用單因素多個樣本的方差分析,P<0.05為差異有顯著性意義。2結果2.1單次給藥后高鉀血癥,未明顯血流引起肝臟心肌梗死豬劈離式原位肝移植后4～48h死亡10只(其中左半肝移植7只,右半肝移植3只),因術中開放門靜脈血流時肝臟再灌注損傷,致高鉀血癥及嚴重酸中毒、出血、膽漏等死亡。其余10只均無明顯胃腸道淤血,術中、術后血流動力學和生化指標均較平穩,且存活時間長,均超過48h(分別于術后3,5,7d人為處死)。手術成功率50%。2.2手術時間和出血受體手術時間3～5h,出血量600～3000mL。2.3表1顯示了血流動力學的變化2.4血管并發癥及其預防從理論上講,劈離式原位肝移植有不少優點,既可保證足夠的空間、提供充足的門靜脈血供,又可充分利用日益有限的肝臟資源。因此,課題組希望建立一種較理想的大動物劈離式原位肝移植模型,以探索手術及麻醉處理方式。豬門靜脈系統發達,其下腔靜脈循環總量約占總循環量的60%,阻斷后勢必影響循環功能,因此本實驗中采取脾靜脈、股靜脈至頸外靜脈的體外靜脈-靜脈轉流,以維持必需的血液回流,防止門靜脈系統淤血及維持血流動力學穩定。此外術中適當的輸血、補液以維持必要的回心血量是維持術中血流動力學穩定性的一個重要方面。本組10只受體在死亡或出現嚴重并發癥后均行受體解剖分析,發現受體死亡與手術技術及麻醉處理密切相關:(1)6只腹腔內出血及血管性并發癥:以術后48h內最多見,表現為持續性的引流管血性液體,腹脹,進行性血壓下降及紅細胞比容降低,主要是由于手術操作失誤及麻醉過程中凝血機制的調整有關,肝上下腔靜脈于左半肝與下腔靜脈的吻合是肝移植手術操作中的難點,要力爭吻合一次完成,此外,術中使用止血環酸、應用葡萄糖酸鈣等藥物改善凝血機制也非常重要。血管并發癥的出現與縫合時縫線收得過緊、扭曲有關,扭曲的惟一辦法是切除吻合口,重新縫合,這將顯著延長無肝期時間及麻醉時間,造成內環境及血流動力學紊亂,導致受體死亡。(2)膽道并發癥:最常見的為膽漏,經解剖發現2只為吻合口漏,1只為劈離式肝臟斷面漏膽。2只吻合口漏為供、受體膽總管粗細大小不等,膽總管外縫合不夠緊密所致。(3)肝動脈栓塞:本組受體中有2只出現肝動脈吻合口扭曲、成角并局部栓塞形成,麻醉過程中及時調整凝血機制及術后應用抗凝治療等對減少肝動脈血栓發生率非常重要。(4)少尿:有6只受體術后出現少尿,可能與術中出血、補液不足等影響血流動力學及內環境紊亂有關,因此,麻醉過程中監測及時調整凝血機制及糾正酸堿平衡紊亂至關重要。受體肝臟切除后,肝臟代謝功能消失,形成無肝期,雖然體外血液轉流可使下腔靜脈、門靜脈血流轉流入上腔靜脈系統,但植入肝血流開放后,供肝內大量高鉀保存液的釋放使受體出現明顯的內環境系統紊亂,表現為嚴重的代謝性酸中毒和高鉀血癥[7,8,9,10,11,12,13,14],本實驗表明植入肝開放后標準碳酸氫根、全血緩沖堿明顯下降(P<0.05),血K+升高(P<0.05),其中1只甚至因明顯的高鉀血癥而出現突發的心動過緩即測血K+為7.38mmol/L,經積極處理后雖有好轉,但仍于術后不久死亡。因此積極預防糾正再灌注后酸堿平衡失調及電解質失衡也是提高受體成活率的關鍵之一,實驗在后續的麻醉中在移植物血流開放前糾正血液pH值至正常上限,而糾正K+至正常下限,并應用較大量的葡萄糖酸鈣,可以使開放后大量酸性產物及高K+得到緩沖及對抗,從而減少酸性產物及高K+對心臟的直接影響,降低麻醉風險。低體溫也是肝移植中普遍存在的現象,可導致明顯的生理功能異常,如凝血功能紊亂、嚴重心律失常、嚴重的代謝性酸中毒、蘇醒困難等[7,8,9,10,11,12,13,14]。本實驗中因創面大,散熱量較大;供肝需在低溫(4℃)中保存;輸血、輸液量較大,所以受體體溫下降十分明顯。在靜脈-靜脈轉流期間,可利用變溫器控制保持體溫,故體溫下降不明顯。在轉流停止、供肝血流開放后,失去了體外循環保溫,且大量冷灌注血液回流入體循環,故體溫下降明顯。此時,采取各種措施保持體溫尤為重要,如變溫毯,溫水灌洗腹腔、輸入加溫的液體等。本實驗采用溫控溫度計監測鼻咽溫度,但未測肛溫,亦未進一步研究低體溫對肝移植術中全身生理狀況的影響。綜上,作者認為劈離式原位肝移植的麻醉處理中,維持全肝阻斷與開放前后血流動力學穩定,糾正與維持酸堿平衡與電解質紊亂,是手術麻醉成功的兩大關鍵,另外,術中維持適當的體溫亦是提高受體成活率,減少術后并發癥的重要方面。文章亮點:豬同種異體原位劈離式肝臟移植模