微藻毒素誘導克氏原螯蝦血紅蛋白釋放的研究

淡湖泊內的藍色海藻洪水的發生頻率和嚴重程度呈快速增長趨勢，引起了全球生態災害。無脊椎動物血細胞的吞噬作用是動物先天性細胞免疫的主要方式,一般而言,血細胞通過吞噬作用清除進入血淋巴中的病原體。在臨床醫學或實驗室,為了檢測實驗動物的先天性免疫能力,通常會選擇血細胞的吞噬指數作為衡量免疫力水平的指標。而為了快速、準確地檢測血細胞的吞噬能力,選擇一種效果明顯、易觀察的感染源十分必要。在研究吞噬作用中,不同學者采用不同的感染源。目前大部分的研究方法都是使用金黃色葡萄球菌、酵母細胞和酵母聚糖A等作為吞噬源,通過Gimesa染色,結合顯微鏡來評定血細胞吞噬外源異物的能力基于以上現狀,本試驗擬通過構建能表達EGFP的大腸桿菌作為吞噬源,結合熒光顯微鏡來檢測克氏原螯蝦血細胞的吞噬能力,進而評價被試動物機體的免疫能力。1材料和方法1.1試驗材料質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司,E.coli菌株DH1.2測試方法1.2.1表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌結合劉利平挑取陽性單克隆菌落,在LB培養基中37℃下培養12～24h,達對數增長期后離心收集表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌,用磷酸鹽緩沖液(PBS:137mmol/LNaCl,12.7mmol/LKCl,10mmol/LNa1.2.2克氏原生殖蝦血淋垂培養參照魏靜等1.2.3試驗設計參照劉利平1.2.4外周血象的外周血一時采取不同外周血比例的平均外周血一時三法取15個視野為例(視野中的總細胞數超過100),在熒光倒置顯微鏡下,統計每個視野中的總血細胞數、參與吞噬作用的血細胞數以及具有吞噬作用的血細胞中被吞噬的大腸桿菌數目,將15個視野中各個指標累積,以下列公式分別計算血細胞的吞噬百分比及吞噬指數,統計結果采用SPSS13.0分析。2結果與分析2.1轉換后，lb包括mp培養基的驗證板DH2.2假陽性克隆的凈化涂布于含Amp的LB平板上的細菌生成的單菌落中,有假陽性克隆的存在,即pEGFP并不是成功轉入大腸桿菌,而是附著在大腸桿菌的表面。為避免假陽性克隆的干擾,需進一步的驗證。隨機挑取陽性單克隆菌落,在LB培養基中37℃培養12～24h,達對數增長期后離心收集表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌,用PBS漂洗3遍,以去除培養基,熒光倒置顯微鏡下經激發光照射、鏡檢。熒光顯微鏡下可以觀察到大腸桿菌通體呈明亮的綠色熒光(圖2,封二),說明pEGFP成功轉入大腸桿菌體內,并穩定表達。該綠色熒光在激發光照射下不易淬滅。2.3熒光及熒光照射對克氏原螯蝦有機分離的影響圖3(封二)為激發光及可見光共同照射時熒光倒置顯微鏡下可見的克氏原螯蝦血細胞對大腸桿菌的整個吞噬過程。經掃描電鏡和顯微鏡觀察,克氏原螯蝦血細胞直徑為5～10μm。圖3A為在熒光及可見光照射下見到的能表達綠色熒光的大腸桿菌;圖3B為熒光及可見光照射下見到的克氏原螯蝦的血細胞;圖3C、D為熒光及可見光照射下可見到的血細胞對大腸桿菌的粘連與聚集狀態,圖3C、D清晰可見表達綠色熒光的大腸桿菌粘連與聚集在血細胞周圍;圖3E、F為在熒光及可見光照射下可見到的血細胞對大腸桿菌的吞噬現象,其中圖3E右下角處可以清晰地觀察到5個被血細胞吞噬的能表達綠色熒光的大腸桿菌,圖3F中可以觀察到血細胞吞噬了4個能表達綠色熒光的大腸桿菌。2.4mc和甲醇聯合處理作用后外周血紅細胞感染情況各試驗組之間吞噬百分比的統計結果(圖4)并沒有顯著性差異,甲醇(空白組)作用后,血細胞的吞噬百分比和對照組相比有上升的趨勢;MC和甲醇聯合(處理組1、2、3、4)作用后,血細胞的吞噬百分比與對照組相比有下降的趨勢,并存在一定的劑量效應。吞噬指數的統計結果(圖5)表明,MC作用后,對照組與空白組、4個處理組均有顯著性差異;其中對照組與處理組1、處理組2和處理組3的差異極顯著,而空白組和4個處理組間沒有顯著性差異,各處理組之間均沒有顯著性差異。3mc的聯合作用血細胞在無脊椎動物免疫中起著重要的作用,它既是細胞免疫的主要參與者,也是多種體液免疫的載體。吞噬作用是指細胞把入侵的病原體(如細菌和病毒))轉運到細胞內并加以清除的過程,此過程構成了生物體先天免疫的第一道防線蝦類的免疫功能主要是通過血細胞來完成的,它既是免疫細胞的擔當者,又是體液免疫的提供者。根據有無顆粒、顆粒多少及顆粒大小為依據可以將蝦血細胞分為透明細胞、小顆粒細胞和顆粒細胞目前認為蝦類免疫主要包括血細胞的吞噬、包裹、凝集和溶菌活性以及血淋巴中的免疫應答因子,其免疫過程可能為:當外界異物侵襲機體時,異物表面的分子作用于宿主的半顆粒細胞,細胞受體與“非己”分子結合,刺激細胞產生胞吐作用進行脫顆粒,把酚氧化酶原系統釋放到周圍介質中。隨后酚氧化酶被激活,活化過程中產生一系列的活性物質,促進血細胞的吞噬、介導凝集和凝固,產生殺菌物質,從而消除入侵的病原和外來異物本試驗結果表明,MC作用后各組之間吞噬百分比并沒有顯著性差異,這可能與各類細胞在免疫應答反應所起的作用有關,顆粒細胞并不參與吞噬作用,MC作用后可能并沒有改變各類細胞在免疫應答反應中的功能。MC和甲醇聯合作用后,克氏原螯蝦血細胞吞噬指數顯著降低,抑制血細胞識別異物和吞噬包囊的功能;吞噬指數與MC的濃度存在劑量效應,MC濃度只有1μg/L時,吞噬指數百分比最低、僅為1.37225;而當MC濃度達到1000μg/L時,吞噬指數有所升高。隨著MC暴露時間的延長,血細胞損傷嚴重。試驗中發現,吞噬時間過久,有必要縮短吞噬時間;12h(1μg/L)作用后,用PBS沖洗平板,視野中的細胞數量極少,且視野中的細胞基本都為透明細胞,可見的細胞中充滿大腸桿菌。這可能是因為MC的毒性比較強,導致血細胞大量死亡或者是血細胞的貼壁作用減弱,PBS一沖就全部脫落。隨著MC濃度的升高,克