uflc-msms法同時測定當歸中的農藥殘留

當歸（oliv.）是波形科的一種藥物，屬于多年生草本植物。現代藥理和臨床研究表明,當歸對多種疾病特別是心血管系統疾病有很好的療效,同時具有抗腫瘤、改善肺功能、提高免疫力等藥理活性。近年來由于當歸種植面積擴大,病害逐年加重農藥多殘留分析需解決的主要問題之一是去除共提取基質干擾物對定量準確度、靈敏度及儀器污染的影響。因此,樣品前處理中對基質凈化方法的選擇及優化是多殘留檢測的關鍵。固相萃取技術具有吸附容量大、凈化效果好、易與檢測儀器聯用等優點,已廣泛應用于中藥材農藥多殘留分析傳統的儀器檢測方法,如氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC),難以消除復雜基質的干擾。氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)雖在中藥材農藥殘留檢測方面做出很大的貢獻,如程志等本文對固相萃取前處理方法中提取和凈化步驟進行了優化和評估,結合靈敏度高、抗干擾能力強的LC-MS/MS技術,以基質匹配校準曲線內標法一次進樣即可完成當歸藥材中多類別農藥殘留的定性、定量分析,并應用于實際樣品的分析檢測。該方法具有操作簡單、靈敏度高、應用廣的特點,對當歸藥材的安全監測有重要的意義。1實驗部分1.1儀器、檢測和分析QTRAP5500質譜儀,配有電噴霧離子源、三重四極桿-線性離子阱質量分析器及Analyst1.6.2工作站(美國ABSCIEX公司)、MultiQuant3.0.2數據處理軟件;LC-30ADUFLC液相色譜系統(日本島津公司)。乙腈為色譜純(德國Merck公司);無水硫酸鎂為優級純(Sigma-Aldrich);醋酸鈉為分析純(天津市化學試劑一廠);PSA固相萃取柱(500mg/6mL)、CARB固相萃取柱(500mg/6mL)、CARB/NH135種農藥及其代謝物、內標d中藥材樣品(10批當歸),產地為甘肅,由天津天士力中藥資源有限公司提供。1.2標準溶液的配制單標準儲備液:取各農藥標準品10mg(精確至0.001mg),分置于10mL量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,制成質量濃度為1.0g/L的單標準儲備液,儲存于4℃冰箱中,備用。混合儲備液:分別準確吸取適量單標準儲備液,用0.05%(v/v)乙酸乙腈溶液定量稀釋,制成各農藥組分質量濃度均為1.0mg/L的混合儲備液,于-20℃冰箱中保存。內標溶液:取d標準工作溶液:準確吸取系列體積的混合儲備液,分置于5mL量瓶中,各加入內標溶液50μL,用乙腈稀釋至刻度,制成質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、80μg/L的標準工作溶液。基質匹配標準溶液:按照1.3節步驟提取不含目標化合物的“空白”樣品,將獲得的提取液作為稀釋溶劑,按照上述“標準工作溶液”的配制,制成相同濃度梯度的基質匹配標準溶液。1.3硫酸鎂-醋酸鈉體系稱取當歸藥材粉末2g(精確至0.01g),置于50mL離心管中,準確加入內標溶液100μL、水10mL,浸潤30min后,準確加入乙腈10mL,于渦旋混合振蕩儀振蕩(5000r/min)2min,向離心管中加入無水硫酸鎂4g和醋酸鈉1g,手動振搖5min,離心(5000r/min)5min。取上清液1mL,加至預先用乙腈-甲苯(20∶1,v/v)5mL活化的固相萃取小柱中,用乙腈-甲苯(20∶1,v/v)20mL分4次淋洗小柱,合并洗脫液,在38℃水浴中旋轉蒸發至近干,用乙腈1mL溶解殘渣,經0.22μm濾膜過濾,濾液作為供試溶液。1.4ufc-ms條件1.4.1萃取條件和梯度洗脫程序色譜柱:AcquityHSST3柱(100mm×2.1mm,1.8μm,Waters公司);流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);流速:0.3mL/min;梯度洗脫程序:0~1.0min,95%A;1.0~4.0min,95%A~40%A;4.0~14.0min,40%A~0%A;14.0~15.0min,0%A;15.0~18.0min,95%A。1.4.2風速msm模式離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:依賴保留時間的多反應監測(scheduledMRM)模式;離子化電壓(IS):5500V;霧化溫度(TEM):550℃;氣簾氣壓力(CUR):241.3kPa(35psi);噴霧氣壓力(Gas1):379.3kPa(55psi);輔助加熱氣壓力(Gas2):379.3kPa(55psi);碰撞氣壓力(CAD):中等(medium)。2結果與討論2.1農藥種類的選擇本研究根據農藥的理化性質,依據GB/T20769-2008,并參考美國、歐盟等國家和組織2.2流動相的優化采用MS-only模式,直接進樣方式,對單一化合物逐個進行優化。首先進行Q1全掃描,識別目標物的母離子,參考歐盟指令(2002/657/EC)為了保證各農藥化合物具有良好峰形以及足夠的靈敏度,本文考察了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)以及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10mmol/L甲酸銨)4種流動相體系。甲酸的加入,可促進化合物的離子化2.3樣品預處理方法的優化2.3.1水用量對提取效果的影響由于中藥材含水量較少,直接使用有機溶劑難以有效提取待分析物。因此需加入一定量的水,以確保樣品中的待分析物較容易地被提取出來。稱取藥材2g,分別加入水5、10和15mL,靜置30min。結果顯示,5mL水不能使藥材完全浸潤,而15mL水量過多,影響液-液分配效率,降低回收率。因此,最終確定中藥材取樣量為2g,添加水量為10mL。2.3.2凈化方法的選擇農藥殘留檢測前處理中常用的提取劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等,本文分別從凈化效果、提取回收率兩方面考察了這3種溶劑對135種農藥及其代謝物的提取情況。從凈化效果(見圖1)看,乙酸乙酯由于對水的溶解度較低,極性干擾物不易被同時提取;丙酮極性較大,且與水互溶,易將水溶性的極性干擾物(如色素)一并提取出來,使后續的凈化步驟難度加大,導致其重復性較差;3者的凈化效果依次為乙酸乙酯>乙腈>丙酮。對135種農藥及其代謝物在0.1mg/kg濃度水平下進行了添加回收試驗,圖2顯示,乙酸乙酯無法從含水基質中完全萃取出極性較大的農藥;與丙酮和乙酸乙酯比較,乙腈適合的農藥極性范圍相對廣泛,是一種較為適宜的提取溶劑;3者的提取效率依次為乙腈>丙酮>乙酸乙酯。綜合考慮,本實驗選擇乙腈為提取溶劑。2.3.3從宏觀上實現有機相的分配在提取液中加入硫酸鎂作為脫水劑能有效減小水相的體積,從而促進分配于水相的極性分析物再分配進入有機相,以獲得高回收率。但是同時考慮到提取的選擇性,在采用硫酸鎂分離的同時,通過改變添加到樣品中的鹽,可以控制該方法的極性范圍2.3.4spe柱的選擇固相萃取方法中常用的SPE小柱有PSA、NH2.3.5洗衣粉和洗滌劑的選擇參考文獻2.3.6對濃縮溫度的研究實驗中發現,洗脫液的濃縮溫度是影響熱不穩定農藥回收率的主要因素,如敵百蟲在一定溫度下會降解生成三氯乙醛、磷酸二甲酯和敵敵畏2.4方法學的檢驗2.4.1標準曲線的繪制將1.2節配制的基質匹配標準溶液進樣,以各組分定量離子的峰面積與內標峰面積的比值(y)對各組分質量濃度(x,μg/L)繪制標準曲線,采用最小二乘法得回歸方程y=a+bx。135種農藥及其代謝物在當歸藥材基質中的響應值與其濃度均呈良好的線性關系,在相應的濃度范圍之內,135種農藥及其代謝物的線性相關系數(r)均大于0.99。定量限(LOQ)是指在可接受的準確度和精密度下,能夠定量測定的樣品中待測成分的最低量或濃度2.4.2基質形成檢測基質效應(matrixeffect,ME)是指樣品中除分析物以外的組分對分析物的離子化產生增強或抑制作用,ME影響分析結果的準確性。本文采用以下公式評價ME:試驗發現,不同農藥在當歸基質中的ME不同。如圖5所示,50多個農藥在當歸藥材中產生明顯的基質抑制效應(ME<70%)。用以補償ME的方法有:基質凈化法、同位素內標法、空白基質配制標準溶液和加入分析保護劑等。內標法不僅可以對ME進行校正、保證回收率,而且可對樣品處理過程中的變化進行校正,有利于方法的穩定性。但對多種類農藥同時檢測時,由于存在極性差異,即使是同類物質的同位素內標也很難抵消ME,造成定量結果偏差。而基質匹配標準溶液法是按照樣品前處理步驟提取不含目標化合物的“空白”樣品,將提取液作為溶劑,配制成標準工作溶液。因此,在LC-MS/MS多殘留分析中采用基質匹配標準曲線-內標法進行校準定量能較好地補償ME。2.4.3添加水平的選擇本文采用基質匹配標準曲線-內標法定量,在無農藥殘留的當歸空白基質中添加135種農藥及其代謝物進行回收率試驗。準確稱取藥材粉末2g,置于50mL離心管中,添加水平分別為10、50和100μg/kg,按照1.3節所述的步驟進行樣品前處理,每個添加水平重復6次。3個添加水平下,除了烯草酮回收率偏低(62.0%~68.2%),其余農藥的平均回收率為71.3%~119.7%,RSD為1.0%~19.9%,數據表明該方法的精密度和回收率都比較好,符合殘留檢測有關標準和法規的要求。2.5定性離子的相對豐度參考GB/T20769-2008,陽性結果的確證依據為:樣品中待測物的保留時間與相應標準品的保留時間偏差在±0.2min以內;同時樣品中各農藥定性離子的相對豐度與相應標準品定性離子的相對豐度必須符合下述標準:相對豐度大于50%,偏差在±10%;相對豐度為20%~50%,偏差在±20%;相對豐度小于10%,偏差在±50%。2.6農藥殘留檢出率應用所建立的分析方法對10批當歸樣品進行農藥的快速篩查。根據2.5節所述定性依據,以保留時間、離子對比率進行定性分析,以定量離子對進行定量分析。在6批藥材中檢出農藥殘留,檢出率高達60%。檢出的農藥有多菌靈、甲拌磷、莠去津、烯唑醇,含量依次為0.010~0.020mg/kg、0.018~0.051mg/kg、0.012~0.018mg/kg、0.015~0.049mg/kg,其中甲拌磷和烯唑醇超出歐盟