克氏原螯蝦肺炎克雷伯菌的分離鑒定

肺炎克雷伯菌屬于腸球菌科克雷伯菌科。這是一種常見的條件性感染。它也是重要的人類疾病。它可能會導致魚、陸地動物和人類的許多感染疾病。2019年5月湖北省潛江市一小龍蝦養殖場發生了小龍蝦“五月瘟”,導致了大量的小龍蝦死亡。筆者通過對患病小龍蝦的病原學檢查發現其存在肺炎克雷伯菌感染的情況,進一步通過回歸感染試驗確定了該分離菌株對小龍蝦的致病力。此外,通過藥敏試驗和最小抑菌濃度測定等方法研究了該分離菌株的敏感性,旨在為小龍蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供參考和依據。1材料和方法1.1菌株和試劑患病小龍蝦樣品采集自湖北省潛江市某小龍蝦養殖場;用于回歸感染試驗的健康小龍蝦來自長江水產研究所荊州基地;抗生素標準品頭孢拉定、氨曲南、氨芐西林、亞胺培南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、多粘菌素E、美羅培南、環丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、氟苯尼考、四環素、苯唑西林、恩諾沙星、多西環素購自北京索萊寶科技有限公司;頭孢唑肟、慶大霉素、阿奇霉素購自上海源葉生物科技有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;細菌基因組提取試劑盒、PCRMasterMix等分子生物學試劑購自TaKaRa公司;腦心浸液(BHI)培養基購自青島海博生物有限公司。1.2肝胰腺的研磨取瀕死小龍蝦在無菌條件下用生理鹽水反復沖洗體表3～5次,在超凈工作臺中剖取小龍蝦的肝胰腺,用生理鹽水沖洗后采用勻漿器將其研磨均勻。取研磨液在腦心浸液(BHI)固體培養基上劃線,將平板置于30℃培養16～20h。從平板中挑取單菌落反復劃線純化2～3次,將得到的純化菌株置于4℃保存,標記為L20190516。1.3菌株生長培養從純化好的平板無菌挑取L20190516菌株的單菌落接種至BHI液體培養基中,30℃振蕩培養至對數生長中期。培養好的菌液用麥氏比濁管稀釋成1.5×101.4形態特征觀察從純化的平板上挑取L20190516菌株的單菌落進行革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察細菌的形態特征。此外,將受試菌株的單菌落用無菌生理鹽水重懸后加入到API20E生化鑒定試劑條上,按產品說明書操作,在28℃條件下培養24h后將鑒定試劑條置于ATB32GN細菌鑒定系統中進行生化鑒定。1.5細菌分子的鑒定參照細菌基因組提取試劑盒操作說明書提取菌株L20190516的全基因,以提取的全基因組作為模板,采用16SrRNA通用引物進行擴增1.6藥物敏感測試L20190516菌株對常用抗菌藥物的敏感性通過紙片擴散法(K-B)進行測定1.7“mics”的測定采用CLSI推薦的肉湯微量稀釋法測定不同抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentrations,MICs)。在96孔板中將配好的抗菌藥物進行倍比稀釋,每孔內藥物體積為100μL,然后加入100μL稀釋好的菌懸液,使每孔中菌懸液的濃度為5×102結果與分析2.1剖檢及細菌分離發病小龍蝦活力降低,應激能力差,采食量下降,進地籠后死亡的現象較多,其中大蝦死亡情況較為嚴重。剖檢發現其肝胰腺發白,腸道內容物較少,肝胰腺積水。采取患病蝦的肝胰腺進行細菌分離,得到的優勢菌在平板上形成半透明、顏色灰白、中央隆起的光滑菌落。經革蘭氏染色鏡檢發現該菌為短桿狀革蘭氏陰性菌。2.2試驗和分離試驗結果健康小龍蝦注射不同劑量的L20190516菌懸液后出現了一定程度的發病和死亡,高濃度攻毒組出現了急性死亡現象,在3d內全部死亡,而陰性對照組在試驗期間沒有明顯的發病和死亡(表1)。感染后的小龍蝦表現為活動減緩、無力等癥狀,剖檢發現其肝胰腺發白,有部分出現積水現象。采用Bliss法得到了該菌株對小龍蝦的LC2.3atb細菌鑒定結果對分離純化的優勢菌接種于API20E生化鑒定條,經過孵育后置于ATB細菌自動鑒定系統中鑒定。結果發現該優勢菌的生化特征符合肺炎克雷伯菌的特征,相似度大于98%。生化鑒定結果見表2。2.41系統發育樹的構建通過PCR擴增得到了分離株L20190516的16SrRNA片段,長度約為1500bp,PCR產物經純化后直接測序。將得到的序列(MT409892)與GenBank數據庫中的已知基因序列同源性比對,構建系統發育樹。結果發現,分離株L20190516與肺炎克雷伯菌(KX237750.1、KU937377.1)、大腸桿菌(LR025099.1)、產氣克雷伯菌(LR134254.1)聚為一支(圖1),同源性為99%。結合該菌株的生理生化特征和系統發育樹情況將該菌株判定為肺炎克雷伯菌。2.5抗菌藥物敏感試驗通過K-B法測定20種化學抗菌藥物的敏感性,其結果見表3。該菌株對頭孢噻肟、多粘菌素B敏感,對新霉素、亞胺培南中度敏感,對恩諾沙星、多西環素、氟苯尼考等16種藥物耐藥。通過肉湯微量稀釋法測定20種藥物的最小抑菌濃度,結果如表4所示。3定了影響定的因素近年來,隨著水產養殖業的迅猛發展,有關水產養殖來源的致病菌的報道越來越多,病害頻發對水產養殖業的發展造成了一定的影響。隨著小龍蝦消費市場的打開,人們養殖小龍蝦的熱情高漲,養殖規模不斷擴大,隨著養殖規模和面積的不