植物總rna提取方法的研究進展

火炬松是中國重要的速生工業材料樹種之一。它現在得到了廣泛的推廣，構成了中國重要的工業材料資源（劉等人，1999）。除用材外松脂產品也具有巨大的經濟效益,廣泛應用于造紙、橡膠、醫藥和飲食等多個領域(宋湛謙,2002)。為了提高火炬松用材材性和松脂產量,對火炬松進行分子水平的機理研究已成為必然。提取高質量的RNA是對植物組織進行分子水平研究的必要前提(王杰等,2015),Northern雜交、cDNA文庫的構建、純化mRNA、RT-PCR/原位雜交等都需要高質量的RNA(杜運鵬等,2010)。但是許多植物組織中富含酚類化合物、多糖、蛋白質和次生代謝產物等,為高質量RNA的提取帶來一定程度的困難,此外DNA污染、內源和外源RNAase的存在都是影響RNA提取效果的主要因素。對于針葉樹種尤其是松科植物高質量的RNA提取難度大,TRIzol法(Simmsetal.,1993)和CTAB法(張玉剛等,2005)等均是常見的RNA提取方法。但是針對火炬松韌皮部或針葉總RNA的提取且有很好提取效果的方法仍然較為少見,這主要是因為火炬松韌皮部和針葉中含有較多難以去除的多糖和多酚類物質。隨著生物技術的飛速發展,目前越來越多的動植物RNA快速提取試劑盒被開發出來,試劑盒的主要特點是,方便、簡單、快捷。但是不同植物組織有不同的優化RNA提取方法。為了篩選出較適合火炬松總RNA的提取方法,本研究中我們根據相關文獻資料和理論知識在常規CTAB法的基礎上進行了稍加改變,得到了改良的CTAB法,并選用了市場上常用5種RNA提取試劑盒,對火炬松的韌皮部和松針進行RNA提取,并對提取的RNA進行了純度和完整性的檢測及分析。1結果與分析1.1瓊脂糖凝膠電泳檢測取3μLRNA樣品結合1μL染料在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測,檢測結果顯示:EASYspinPlusPlantRNAKit和Magzol1.2不同方法提取堅韌皮和針葉總數的純度和濃度280、260和230下的吸光值分別代表了蛋白和分類物質、核酸和碳水化合物的含量,純度高的RNA樣品的OD2植物rna的提取提取到高質量的火炬松總RNA是后續對火炬松開展分子生物學方面研究的必要前提。火炬松最大的特點就是含有較多難以去除的多糖、多酚等次生代謝產物,這為火炬松高質量RNA的提取帶來一定的困難。RNA提取試劑盒因其操作簡單、快捷的特點,并且在許多植物組織中已成功分離出高質量的RNA(趙錦等,2009)而被應用的越來越廣泛。但不同植物組織細胞內外成分具有復雜性和多樣性,而且非常適合火炬松針葉和韌皮部總RNA提取的試劑盒也鮮為報道。對于富含多糖和多酚類的植物材料,用CTAB作為陽離子表面活性劑成分已在許多種植物材料中分離出高質量的RNA(杜運鵬等,2010)。利用CTAB-Licl法從百合花瓣中提取到了高質量的RNA(郝福玲等,2005),利用改良CTAB法從百合葉片中提取到了質量高,產量大,完整性好的RNA(尹慧等,2008)。由于成年火炬松在松針取材上存在一定的困難,本研究中以火炬松針葉和韌皮部為材料,較為常見的5種植物RNA提取試劑盒和根據火炬松自身特性,并在前人CTAB法的基礎上做了適當改動的改良CTAB法為實驗方法。改良CTAB法的基本特點為:裂解液中2%的聚乙烯吡咯烷酮能抑制酚類物質的氧化,3%的β-巰基乙醇可以還原被氧化的酚類物質(Bahlouletal.,1993);高濃度的Licl(10mol/L)選擇性沉淀RNA、多次氯仿/異戊醇的抽提和利用-20℃預冷的無水乙醇沉淀RNA這些措施均能有效的去除多糖;此外SSTE能有效的去除殘留的Licl以防影響后續實驗。所選的植物RNA提取試劑盒中ColumnPlantRNAout2.0和HiPurePlantRNAMiniKit具有較好的提取效果,且韌皮部的提取效果比針葉更好。改良CTAB法在火炬松針葉和韌皮部中均能提取到質量高、完整性好的RNA。說明改良CTAB法比植物RNA提取試劑盒更適合火炬松總RNA的提取。本研究為火炬松RNA提取方法或RNA提取試劑盒的選擇提供了基礎,與此同時也為其他松杉類植物RNA提取方法的選擇上帶來了參考價值。3材料和方法3.1實驗材料3.1.1植物園樣品的提取成年火炬松韌皮部和針葉均采于華南農業大學校內植物園,所取樣品放入free-RNAase的50mL離心管中并迅速放入液氮盒中保存,之后轉入超低溫冰箱中保存。3.1.2depc/rohs/gca水的配制CTAB提取液是參考王暑輝等(2012),按2%CTAB、2%PVP-40、100mM/LTris-HCl(pH8.0濃鹽酸調pH)、25mmol/LEDTA(NaoH調pH8.0)、2.0mmol/LNaCl、0.5g/L亞精胺的比例配置,配置所用水均為用DEPC處理過的水。SSTE溶液按1.0mol/LNaCl、0.5%SDS、10mmol/LTris-HCl(pH8.01mmol/LEDTA(pH8.0),ColumnPlantRNAout2.0提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司、E.Z.N.A.3.2實驗方法3.2.1測試盒法試劑盒法均按照各試劑盒說明書進行操作,其中MagZol3.2.2g火炬松離心研磨法sste改良CTAB法是參考Chang等(1993),Bekesiova等(1999),王杰等(2015)的操作方法,并作適當改動而成的,具體操作步驟如下:(1)取2mL的free-RNAase的離心管,加入1mL的CTAB裂解液和30μLβ-巰基乙醇;(2)用無水乙醇灼燒研缽滅菌后,加液氮冷卻,稱取100mg火炬松韌皮部或針葉于研缽中快速充分研磨,將研磨物轉入2mL離心管中,渦旋混勻30s,65℃水浴15min;(3)13000rpm,4℃離心10min。取上清轉入另一干凈的1.5mL離心管中(盡量避免吸取到沉淀物,可放棄一小部分上清不取);(4)加入和上清等體積的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋混勻30s;(5)13000rpm,4℃離心5min,取上清。加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)渦旋混勻30s;(6)13000rpm,4℃離心5min,取上清,加入1/4體積的10MLiCl溶液。4℃沉淀RNA(一般為9~12h);(7)13000rpm,4℃離心10min,棄上清,加入300μLSSTE溶解沉淀;(8)加等體積氯仿:異戊醇(24:1),渦旋混勻30s,13000rpm,4℃離心5min,取上清;(9)加入兩倍體積預冷的無水乙醇-70℃放置20min。13000rpm,4℃離心8min,