黃麻應用核心種質的構建與鑒定

黃麻是世界上最重要的纖維纖維草本植物。黃麻屬(Corchorus)有100多個種,在生產上有栽培價值的有圓果種黃麻(C.capsularisL.)和長果種黃麻(C.olitoriusL.),兩者皆為二倍體(2n=14)。其纖維具有產量高、纖維質地柔軟的特點核心種質(coregermplasm)有利于提高種質資源的利用效率。不同研究者構建了多種作物的核心種質,如水稻在眾多的分子標記技術中,簡單重復序列SSR(simplesequencerepeat)具有多態性高、數量豐富、重復性好等特點,是一種比較理想的遺傳標記為鑒別核心種質或應用核心種質之間的差異,越來越多的研究者利用分子標記來構建DNA指紋圖譜。目前指紋圖譜的構建方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法本研究從不同來源的黃麻種質資源遴選出應用核心種質,并通過SSR熒光標記毛細管電泳技術構建黃麻應用核心種質的DNA分子身份證,以促進黃麻種質資源的高效利用及快速分子鑒定,并為黃麻優異基因的挖掘奠定良好基礎。1材料和方法1.1試驗材料從300份黃麻種質資源1.2福建桃源試驗依據《黃麻種質資源描述規范和數據標準》該應用核心種質分別于2018年5月1日和2019年5月8日在福建省三明市尤溪縣福建農林大學洋中科教基地農場(東經118°28′44′′,北緯26°17′22′′,海拔174m),按2行區種植,行長3.5m,行株距1.20m×0.10m,采用單因素隨機區組設計,邊行種植2行保護行,田間管理同大田。1.3提取的dna采用改良的CTAB法提取黃麻基因組DNA1.4sr索引46對預選引物序列信息見附表1,所用的SSR引物包括編號CcID參照徐益等1.5核心引物的篩選從供試材料中隨機選12份材料,通過PAGE銀染法對備選的46對SSR核心引物進行初篩,每個引物進行3次重復,選取多態性高、重復性好的引物合成熒光引物。用PIC＿Calc0.6軟件計算多態性信息量(PIC)。1.6分子身份證編碼采用SSR熒光標記毛細管電泳技術,用獲得的核心引物分析該應用核心種質,用3730XL測序列分析儀讀取數據,獲得SSR擴增片段的精確分子量,并進行數字+英文字母編碼。將每對引物擴增所有樣品的不同帶型,按分子量從大到小用數字1～9依次表示,超出9的用英文字母A～Z依次表示,構建字符串形式的DNA分子身份證。將對應字符串導入在線條碼生成器(/html/BCGcode128b.php),生成可供掃描的條形碼DNA分子身份證;將應用核心種質的基本信息、形態特征特性、品質數據、DNA分子身份證代碼等文本信息輸入在線二維碼生成器(https://cli.im/),生成可掃描的二維碼DNA分子身份證。2結果與分析2.1應用核心種質的構建通過包含61份品種(系)的應用核心種質農藝性狀精準鑒定,篩選出纖維產量高(包括高稈、莖粗、鮮皮厚、單株鮮皮重)、纖維品質好(包括高纖維素含量、低木質素含量、高纖維強度、高纖維支數)、抗逆(包括抗炭疽病、抗鹽、抗旱、高發芽率、抗種子老化)、生育期適宜、適宜機械化(抗倒伏)等應用核心種質,加上6份骨干親本,按特性可分為16個應用型,即16組(表1)。剔除不同組內同一種質,共61份品種(系)。2.2核心引物篩選從該應用核心種質的61份品種(系)中隨機挑選12份作為模板,采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物。針對備選的46對SSR核心引物進行初篩,得到12對多態性高且條帶清晰的引物,如表2所示。利用SSR熒光標記毛細管電泳技術及這12對核心引物擴增61份應用核心種質。共檢測到140個多態性位點,等位位點多態性信息含量(PIC)變幅為0.8223～0.9499。2.3核心種質dna分子身份證編碼及編碼組合12對核心引物對該應用核心種質進行SSR熒光標記毛細管電泳,3730XL測序列分析儀讀取分子量數據。圖1為引物CcID071(FAM)熒光毛細管電泳檢測到的19種特征帶型,對應的片段大小分別為104/113、108/129、112/128、113、113/117、113/125、113/126、113/128、113/129、114、114/126、114/129、116/125、117、119/126、122、125、126、129bp。圖2為引物CcSSR024(HEX)熒光毛細管電泳檢測到的4種特征帶型,對應的片段大小分別為196、197、199、200bp。表3為各核心引物5uf0a2端標記的熒光基團、擴增得到的多態性條帶總數、多態性片段大小及編碼匯總。利用毛細管電泳多態性片段及編碼信息構建DNA分子身份證。對毛細管電泳結果按表3進行數字+英文字母編碼,將CcID071、CoSSR083、CoSSR146、CoSSR179、CoSSR049、CcSSR001、CoSSR119、CoSSR133、CoSSR136、CcSSR024、CcSSR015、CoEMS333這12對引物的排列組合用于DNA分子身份證的構建。按上述順序將該12對引物對應的編碼組合,構成應用核心種質DNA分子身份證,即字符串DNA分子身份證。如巴長4號(種質編號:16)的DNA分子身份證編碼為I2457612J227,對照表3,第1個字母I表示引物CcID071在種質16中的擴增片段,在其多態性片段梯度中排第18位,第2個數字2表示引物CoSSR083在種質16中擴增的片段,在其多態性片段梯度中排第2位,其余代碼依次類推。將DNA分子身份證編碼導入在線條碼生成器,生成條形碼DNA分子身份證。將應用核心種質的主要描述符和DNA分子身份證編碼導入二維碼生成軟件,生成二維碼DNA分子身份證。基于字符串、條形碼、二維碼3種形式,成功構建出61份應用核心種質的DNA分子身份證,圖3為構建的應用核心種質條形碼DNA分子身份證和二維碼DNA分子身份證示例。3討論3.1核心種質在黃麻品種選育方面的應用黃麻是我國重要的纖維作物,構建應用核心種質是促進優異基因的深入發掘和提高育種利用效率的有效途徑。本研究構建了包括16種優異應用型在內的黃麻應用核心種質,可以精準地為黃麻多元化及專用化育種提供研究材料。例如,高產、高發芽率、高纖維素含量、低木質素含量、高纖維強度、高纖維支數應用核心種質可用于黃麻的品種改良,抗倒伏應用核心種質將為選育理想株型及適宜機械化的黃麻品種提供關鍵親本,抗炭疽病、抗鹽、抗旱應用核心種質在多抗黃麻品種的選育方面具有重要利用價值。同時,這批應用核心種質的構建也將為黃麻高產、纖維優質、抗逆等優異基因的發掘及功能標記開發等基礎研究提供核心材料,如盧瑞克等在研究鹽脅迫下的生理響應時需選擇強耐鹽材料和鹽敏感型材料,徐益等在鑒定與萌發速率相關的SSR標記時需選擇高發芽率的材料,陶愛芬等在篩選與黃麻炭疽病抗性相關的新型分子標記研究中需要高抗炭疽病材料和高感炭疽病材料。3.2ssr擴增產物檢測方法篩選一批多態性高、重復性好、具有代表性的標記在DNA分子身份證構建中至關重要。SSR分子標記已成為一種最廣泛應用的具有高穩定性的分子標記,目前SSR擴增產物檢測方法主要有聚丙烯酰胺凝膠銀染法和熒光毛細管電泳法2種。郝晨陽等3.3黃麻種質dna分子身份證的應用DNA分子身份證是證實和區分不同材料的有效證明,具有唯一性、可鑒別性等特點。本研究構建的包含61份品種(系)的應用核心種質的字符串、條形碼和二維碼DNA分子身份證,為每份品種(系)獨有的分子身份證,其號碼是唯一的。基于字符串,本研究構建了能夠迅速被電子系設備識別的條形碼DNA分子身份證,但是其無法儲存大量文字等有效信息。而如今二維碼技術的運用有效地容納了數字、文字、字母、圖片等信息,且能夠迅速被電腦、手機等電子設備全方位識別,大大增加了其使用范圍。這些技術的運用使我們構建的黃麻應用核心種質DNA分子身份證可以在種質鑒定和保護上發揮重要作用;也可以用于黃麻種質資源庫