利用熒光標記ssr構建百合種質資源分子身份證

李立偉，中國約47個品種和變種（龍亞宜，張金正，1998）。近50年來已培育的百合品種達9400個(InternationalLilyRegister,/)。隨著育成品種數量的不斷增長以及種質交流的日趨頻繁,準確地鑒別百合品種非常重要。用于種質鑒定的分子標記技術主要包括ISSR、RAPD、SRAP、SSR和SNP等,其中SSR(simplesequencerepeats)分析技術更具有在染色體上分布均勻、多態性豐富、共顯性、分辨率高和易于檢測等優點(Morgante&Olivieri,1993)。Dangl等(2009)采用12對SSR引物構建了18份加利福尼亞扁桃種質的指紋圖譜。Oliveira等(2010)采用48對SSR引物構建了32份大豆種質的指紋圖譜。Pan(2010)利用21對SSR引物構建了1025份甘蔗種質的分子身份證庫;Moriya等(2011)利用15對引物構建了95份蘋果種質的指紋圖譜。楊陽等(2010)利用17對SSR引物構建了湖南省36份茶樹品種(系)的分子指紋圖譜;王黎明等(2011)利用103對SSR引物構建了142份甜高粱品種的分子身份證。由于分子身份證是指紋圖譜數字化后得到的字符串,其構建實現了品種比對的自動化,具有高效、準確和方便的優點,更適合進行大規模的品種比對。目前常用的SSR-PCR分析是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物,但該方法的缺點是不能準確讀出目標DNA片段的大小,檢測效率偏低和難以對大規模不同批次品種DNA指紋鑒定數據進行有效整合(程本義等,2011)。與常規的凝膠電泳檢測法相比,基于DNA測序儀的SSR熒光標記毛細管電泳檢測方法可以得到目標DNA片段的準確大小,檢測結果更為精確,適用于大批量樣品的檢測分析。SSR熒光標記毛細電泳檢測技術已成功應用于小麥(Fujitaetal.,2009)、無花果(Achtaketal.,2009)、甘蔗(Pan,2010)、大豆(Oliveiraetal.,2010)、蘋果(Moriyaetal.,2011)、水稻(程本義等,2011)、棗(麻麗穎等,2012)和梨(高源等,2012)等的品種鑒定研究中。近年來在百合中也開發了一批穩定性好的SSR標記,并已應用于系統進化和遺傳多樣性等研究中。楊素麗等(2008)和Lee等(2011)先后利用NCBI上的百合EST序列開發了一批SSR引物;葛亮等(2012)利用19對SSR核心引物對部分百合資源進行了遺傳系統進化分析;Kawase等(2010)和Sakazono等(2013)利用雙重抑制PCR技術開發了一批SSR引物;Yuan等(2013)利用岷江百合(L.regale)轉錄組數據開發了494對SSR引物。這些工作為利用SSR引物構建百合的分子身份證奠定了良好基礎,但至今尚未見相關研究報道。本試驗中利用篩選到的SSR引物,采用熒光測序技術結合新的帶型編碼方式構建96份百合樣本的分子身份證,并探索高精度、高通量和高效率構建百合分子身份證的技術體系,以期為品種鑒定和親緣關系分析等相關研究提供參考。1材料和方法1.1蔬菜花物學試驗于2010年10月至2012年6月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所進行。試驗材料共96份,其中包括22個原生種,74個雜交品種。1.2ssr引物合成及優化選取新鮮的百合幼葉,用改良CTAB法(Beeketal.,1992)提取各樣品材料的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度,并將其濃度稀釋至50ng·μL從Yuan等(2013)報道的172對EST-SSR引物中篩選出擴增條帶清晰、穩定、多態性高的20對引物(表1)用于樣品的擴增。合成20對熒光標記引物,每4對標記為一組,共分5組,每組4對引物的正向引物上分別加注的熒光染料為6-FAM(藍)、HEX(黃)、TAMRA(黑色)和ROX(紅)熒光基團(表1),由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。SSR-PCR反應體系參照葛亮等(2012)的體系進行。采用溫度梯度PCR(GradientPCR)對引物退火溫度進行優化,得到各對引物合適的退火溫度(表1)。PCR循環條件是:94℃預變性5min;94℃變性30s,合適退火溫度退火30s,72℃延伸45s,35個循環;72℃延伸7min。反應在Bio-RadPTC-200上進行。1.3熒光標記產物片段大小測定對96份百合樣品熒光標記引物的擴增產物進行純化,去除殘留的鹽分、蛋白質等雜質;取純化后的熒光標記引物擴增產物2μL,4種熒光標記引物6-FAM、HEX、TAMRA、ROX擴增產物分別稀釋50倍、30倍、10倍、10倍;將每組的4種熒光標記產物每種取1μL混合,離心混勻,取1μL加入96孔板中;按每孔10μL體系,每孔含1μL稀釋后的擴增產物、8.9μL甲酰胺和0.1μL片段大小標準GS500(-250)LIZ,計算所需甲酰胺和LIZ的量,將兩者混合做成預混液,分裝到96孔板中;95℃變性5min,置冰上10min,離心后在ABI3130xl遺傳分析儀上進行片段大小測定;用GeneMapper對上機結果進行片段大小及基因分型分析。1.4帶型的編碼和編碼利用20對引物對96個樣品進行擴增,得到各樣品擴增的指紋數據,將指紋數據轉換為數字編碼,即分子身份證。轉換方法如下:將每對引物在某一樣品上擴增出的每一種帶型用個位阿拉伯數字1,2,3,……,9編碼表示,為保證每一種帶型只占一位數字,帶型數大于9時,分別用a,b,c代表第10,11,12種帶型,依次類推,無帶用0表示,這樣,每種引物在某一樣品上的擴增帶型用1位數字或字母表示;按照引物擴增帶型數由少到多的順序,將每個樣品在20對引物上的擴增帶型數據串聯起來,即得到每個樣品以20位數字或字母表示的分子身份證。2結果與分析2.1pcr檢測結果如表1所示,20對SSR引物對96份百合種質資源進行擴增,共檢測到69個等位位點,每個引物檢測到的等位位點2~6個,每對引物平均3.45個。共檢測到170個帶型,每個引物檢測到帶型數3~17個,每對引物平均8.50個。擴增的片段長101~471bp。由于采用四重熒光毛細管電泳技術,可以完成對4對引物擴增條帶的同時檢測,檢測的效率得以顯著提高。圖1為引物ivflmre125在‘Rita’、‘Prato’和‘Brunello’間的擴增帶型。2.2分子身份證編碼按表2引物的順序即ivflmre125、ivflmre342、ivflmre1014、ivflmre407、ivflmre422、ivflmre138、ivflmre771、ivflmre141、ivflmre302、ivflmre179、ivflmre588、ivflmre79、ivflmre486、ivflmre381、ivflmre136、ivflmre725、ivflmre768、ivflmre738、ivflmre100和ivflmre1024,將每對引物在樣品上擴增的帶型編碼進行串聯排列,得到96份樣品的分子身份證代碼(表3)。得到的96個供試材料的分子身份證代碼均不相同,能夠將所有種或品種區分開,在對應的位置上,代碼相同表示該引物在樣品上擴增帶型相同。此外,由于不是來自同一個克隆的無性系,來自不同產地的3個湖北百合(L.henryi)樣品76、94和96的分子身份證互不相同,來自不同產地的兩個川百合(L.davidii)樣品87和93的分子身份證也不相同。3討論3.1熒光標記ssr毛細管電泳檢測結果SSR標記已被證明是一種具有高穩定性和高準確性的分子標記(Powelletal.,1996;明軍等,2002)。此外,在對SSR-PCR擴增產物檢測的方法中,基于DNA測序儀建立的熒光標記SSR毛細管電泳檢測法可以得到目標DNA片段的準確大小,檢測結果更為穩定、準確和高效,更適用大批量品種的檢測分析。龔亞明等(2009)針對豌豆的研究表明,EST-SSR熒光標記毛細管電泳檢測法具有很好的重復性,表現很高的穩定性。程本義等(2011)對水稻的研究表明SSR熒光標記毛細管電泳檢測法的數據具有高重復性、高準確性。本試驗利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法對熒光標記SSR毛細管電泳檢測法的結果進行了驗證,結果顯示兩種檢測技術的結果完全一致(數據未列出),表明該檢測方法可以對目標DNA片段進行準確檢測,結果可靠。3.2分子身份證的應用與不足指紋圖譜和分子身份證是兩個不同的概念。指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜,其鑒定品種的基礎在于對比電泳圖譜中的差異來區分品種(高運來等,2009),但由于指紋圖譜存在譜帶較多、人工比對判讀費時費力和統計分析較繁瑣復雜等問題,限制了其在大規模品種鑒定中的使用。而分子身份證是指在得到電泳圖譜的基礎上,通過運用不同的編碼方式對電泳圖譜進行數字化處理后得到字符串形式的結果。相對于指紋圖譜,分子身份證能夠簡單明了地區分品種間的差異。由于分子身份證是指紋圖譜數字化后的結果,這樣就可以通過計算機對各品種的分子身份證自動比對,使品種的比對更加高效、方便和準確,從而克服了指紋圖譜進行人工比對的繁瑣、低效等問題,可以在大規模品種比對中廣泛使用。3.3分子身份證編碼構建分子身份證的編碼方法主要有以下3類:(1)根據SSR指紋圖譜,以1和0分別代表某個等位基因位點擴增DNA條帶的有無,將SSR圖譜轉換為由1和0組成的字符串,即構成分子身份證(Ohtsubo&Nakamura,2007;劉新龍等,2010;趙新燕等,2010)。也有在此基礎上將二進制轉化成十進制進行編碼(郝冬梅等,2011)。(2)將每對引物擴增的條帶按從小到大排列,依次編碼;有兩個等位基因時取其中堿基數較少的一個(陳昌文等,2011)。(3)將獲得一系列帶型用數字進行編碼,按照固定引物順序,串聯各帶型編碼,即可形成一組數據,也就是該品種的分子身份證(王立新等,2006,2007)。本研究中所使用的分子標記是EST-SSR標記,為充分利用每一個位點的帶型數據,雜合帶型也進行了編碼,這樣可以充分利用引物區分更多的品種。本研究中所用的20對引物,只擴增出69個等位位點,而帶型卻有170種,多態性增加了1倍之多。在對帶型編碼時,首次采用0到9的10個個位數字和26個小寫英文字母對帶型進行編碼,使一對引物在分子身份證上對應一位數或一個字母,書寫簡潔,從而避免了僅使用數字對帶型編碼時,因引物擴增帶型過多需要使用兩位數字進行編碼的情況。研究者在選取分子身份證的編碼方法時,應根據研究對象的特點,秉著統計方便,書寫簡潔的原則進行。針對SSR標記多態性豐富的作物,可以采取第二種編碼方法進行編碼。針對SSR標記多態性不好或者引物不足的作物,為了充分利用帶型的多態性可以采用本研究中使用的編碼方式進行編碼。3.4編碼更新數據庫的增加世界各國育種機構每年都有大量的百合新品種育成并推向市場,所以,必須建立新品種的分子身份證來及時更新數據庫。隨著新品種的不斷增多,可能產生本研究中不包含的新的帶型,此時可以按照本研究的編碼方法對新的基因型進行編碼。理論上每對引物最多可以編碼36(10個個位數和26個小寫字母)種帶型,所以,利用所選用的20對引物最多可以區分203.5分子標記不一定和重要的