植物基因組學PlantGenomics浙江大學(農業與生物技術學院)蔣立希教授概述基因組學的定義基因組——細胞中所有的DNA，包括所有的基因和基因區域。染色體上的DNA、細胞器中的DNA。基因組中不同的區域具有不同的功能，有些是編碼蛋白質的結構基因，有些是復制或轉錄的調控信號，有些區域的功能還不清楚。基因組學——研究基因組的一門學問。“基因組學”這個詞最早于1986年由美國科學家ThomasRoderick提出，是一門關于基因組圖、測序和基因組分析的科學。這門科學還在迅速發展之中，但側重點已經從當初的作圖與測序，到基因組功能的研究。為了反映這個轉變，基因組分析可以分成“結構基因組學”與“功能基因組學”兩個大部分。電子顯微鏡下面染色體的外觀

Confocal顯微鏡下面植物染色體的外觀為什么要研究基因組？1、基因組研究的目的是從全局上闡明一種生物中所有遺傳信息的組織和功能。2、基因組研究的內容包括所有水平上遺傳信息的加工及基因和基因產物之間的相互作用，以及基因組的比較和進化。結構基因組學和功能基因組學結構基因組學：研究基因組的結構，是基因組研究初始階段的主要工作。最終目的是構建某一個物種高分辨率的“遺傳圖”、“物理圖”、以及“轉錄本圖譜”。某個物種最終的物理圖譜，是它的完整的DNA序列。基因組圖分別率基因組圖：細胞學圖、遺傳圖、物理圖、序列圖，分辨率逐級提高基因組學結構基因組學功能基因組學基因連鎖分析分子細胞學物理作圖EST測序全基因組測序全基因組的結構基因的表達正向遺傳學反向遺傳學生物信息學比較基因組學蛋白質組學等等基因組研究的特點基因組研究是基因組學的核心內容。或者說，基因組學其實就是基因組研究。基因組學是高效的遺傳學。與傳統的遺傳學比較，基因組學具有全局性、高效性、綜合性和先進性的特點。1、全局性（Overall,genome-wide）：以整個基因組為研究對象，而非具體到單個特定的基因。2、高效性（High-throughput）：研究方法是平行的、高通量的，一次試驗可產生大量的數據。3、綜合性：需要多學科的合作，包括生物學、化學、統計學、機械技術、電子技術、信息技術等。4、先進性：將現有各種最先進的技術應用到極至，同時也推動了各種技術的高速發展。真核生物與原核生物基因組的區別基因組大小染色體著絲粒染色體端基因組結構重復序列真核生物大多條線狀有有基因排列松散被內含子間隔高原核生物小單染色體環狀無無基因排列緊密無內含子沒有或很低真核生物與原核生物基因組的一些例子支原體布魯氏科寄生菌裂殖酵母基因組的大小基因組的大小：指的是物種單倍體基因組的大小。即便是同一個物種，它不同的細胞，所攜帶的染色體倍數是不同的：性細胞的染色體組數目是體細胞的一半。基因組的大小可以通過C值來表示，C值的大小通過DNA雙鏈解開與復合的速率來測算。基因組的大小–CValue基因組越大，DNA重復序列越多DNA雙鏈退火重合所需時間越長，C值越高基因組的大小–C0T1/2C0T1/2=“DNA濃度”與“雙鏈退火復合所需時間一半”的乘積，這個乘積直接與基因組內DNA的數量相關。物理參數與實測堿基對數目間的相關性

物種之間基因組大小的差別

物種間基因組的大小差別巨大，從病毒基因組的5x103bp到植物的103Mb。在哺乳動物之中，最大的基因組只是最小的基因組的兩倍；而在植物界，物種之間基因組的大小差異達100倍之多。物種之間基因組大小的差別

爬行軟骨質的魚棘皮類甲殼類軟體動物支原體1kb10kb100kb1Mb10Mb100Mb1Gb10Gb100Gb部分植物基因組大小之比較

基因組序列的重復性

在一種生物類別中，基因的數目其實并不相差太大，而基因組的大小的差別卻有100倍之多。例如，在開花的植物之中，基因數目在3-5萬個之間，而基因組的大小卻相差巨大，擬南芥的基因組是小麥的百分之一。因為在大型的基因組中存在著大量的重復區域。一些物種基因組內不同序列類別的比例

斑馬魚鼠蛙DNA重復序列

DNA重復序列：指在基因組中，超過一個拷貝的重復序列。串聯重復序列(Tandemrepeats)：指在基因組中，前后相連的重復序列。分散的重復序列(Dispersedrepeats)：指分散在基因組不同區域的重復序列。兩種分散的DNA重復序列

SINES(ShortInterspersedElements)：片斷小于500bp，重復次數在100,000-1000,000LINES(LongInterspersedElements):片斷大于5KB,重復次數10000次以上。內含子與外顯子2、外顯子(Extron)：一個基因的編碼區域。1、內含子(Intron):不翻譯成蛋白質的DNA序列片斷。最早在1977年的時候，雞的蛋白清，以及兔子、老鼠的血色素蛋白中發現。在原核生物與低等的真核生物（如酵母）中，很少有內含子。不同物種基因外顯子數目統計三個物種基因內含子數目統計酵母果蠅染色體上重復序列的位置常染色質常染色質串聯重復串聯重復DNA微衛星內含子、外顯子、LINEs、SINEs、微衛星與mini微衛星內含子、外顯子、LINEs、SINEs、微衛星與mini微衛星串聯重復異染色質異染色質小結1、原核生物與真核生物的基因組大小相差極大。2、在同一類生物之中，不同物種基因的數目相差并不大，但基因組的大小差別卻可以達到100倍之巨。3、基因組的越大，重復序列的比例也越高。4、越是高等生物，單個基因平均內含子與外顯子的數目也就越多。第一講基因的表達及全基因組基因表達研究1.1何謂基因的表達1.2如何分析單個基因的表達1.3如何在全基因組水平上研究基因的表達Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents1.1何謂基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein轉錄逆轉錄翻譯基因表達(geneexpression)是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子。生物體內的各種功能蛋白質和酶都是同相應的結構基因編碼的。差別基因表達(differentialgeneexpression)指細胞分化過程中，基因按一定的時空順序表達，表達的基因數約占基因總數的5%～10%。也就是說，某些特定基因表達的結果生成一種類型的分化細胞，另一組基因表達的結果導致出現另一類型的分化細胞，這就是基因的差別表達。其本質是開放某些基因，關閉某些基因，導致細胞的分化。Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何謂基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein轉錄逆轉錄翻譯在RNA聚合酶的催化下，以DNA為模板合成mRNA的過程稱為轉錄（transcription）。在雙鏈DNA中，作為轉錄模板的鏈稱為模板鏈（templatestrand）或反義鏈（antisensestrand）；而不作為轉錄模板的鏈稱為編碼鏈（codingstrand），編碼鏈與模板鏈互補，它與轉錄產物的差異僅在于DNA中的胸腺嘧啶（T）變為RNA中的尿嘧啶（U）。在含許多基因的DNA雙鏈中，每個基因的模板鏈并不總是在同一條鏈上，亦即可作為某些基因模板鏈的一條鏈，同時也可以是另外一些基因的編碼鏈。轉錄的過程Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何謂基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein轉錄逆轉錄翻譯分子雜交Genome-wideanalysisofgeneexpression分子雜交（molecularhybridization）確定單鏈核酸堿基序列的技術。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。1.1何謂基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsDNARNAAminoacidsProtein轉錄逆轉錄翻譯翻譯的過程以mRNA作為模板，tRNA作為運載工具，在有關酶、輔助因子和能量的作用下將活化的氨基酸在核糖體上裝配為蛋白質多肽鏈的過程。這個過程包括肽鏈的延長、肽鏈的終止，以及譯后加工（postranslationalprocessing）：從核糖體上釋放出來的多肽需要進一步加工修飾才能形成具有生物活性的蛋白質。翻譯后的肽鏈加工包括肽鏈切斷，某些氨基酸的羥基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。）。Genome-wideanalysisofgeneexpression1.1何謂基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionATGTAATGATAGORF=OpenReadingFrameCDS=CodingSequenceExtron/IntronURT=UntranslatedRegion5’regulatingsequencePromoter/Stopsequence1.2如何分析單個基因的表達PlantGenomicsforundergraduatestudentsRT-PCRRT-qPCRNorthernBlot報告基因（GUS,GFP）原位雜交Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudentsProceduresandPrinciplesStep1:Denaturing94-95oC,3min.Step2:Denaturing94-95oC,50sec.Annealing55oC,1min.Extending68-72oC,1k/1min.Step3:Extending68-72oC,10min.Step5:Storageat4oC,forever30-35cyclesnormally5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’

PCRtechnology(1)Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents

PCRtechnology(2)5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Theoretically,thenumberofDNAmolecules=2nn=numberofPCRcyclesNumberofcyclesNumberofDNAMolecules10203040Genome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudents

PCRtechnology(3)Theoretically,thenumberofDNAmolecules=2nn=numberofPCRcyclesNumberofcyclesNumberofDNAMolecules10203040PCRcocktails:Buffer(10x)normally1/10dNTP1μlfor25mM

MgCl21μlfor10mM

DNATemplate60-1000ngTaqpolymerize60-1000ngFactorscausinglowPCRefficiencyTissuesPrimersGenome-wideanalysisofgeneexpressionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpressionpattern–withRTPCR(1)100bp500bp1.0kb100bp500bp1.0kbABSeedling

Leaves

FloralbudsSsiliquestage1Ssiliquestage2Ssiliquestage3Ssiliquestage4ActinBnALCSterilewaterSeedling

Leaves

FloralbudsSsilique1Ssilique2Ssilique3Ssilique4SterilewaterPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpressionpattern–withRTPCR(2)

M12345HomozygousmutantRNAHeterozygousmutantRNAWidetypeRNAForanyPCRexperiment,controlisveryimportantPositive:4(m)and5(w)withactinspecificprimersNegative:3waterwithgenespecificprimers122PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withQuantitativePCRTechnology(1)NumberofDNAMolecules1020304050PCRCyclesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withQuantitativePCRTechnology(2)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(1)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(2)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withNorthernBlot(3)1049bp595bp45321b1a2345678PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionPTGUSReporter:VGD1Promoter-GUS-Tnos

Studygeneexpression–withGUSreportergenePlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGUSreportergeneGUSReporter:ALCPromoter-GUS-TnosPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGFPreportergeneGFPReporter

:

VGD1Promoter-GFP-TnosPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withGFPreportergenesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withRFP/YFP/GFPreportergenesPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withinsituhybridizationThetpd1mutantlackstapetalcellsATA7Probe(tapetum-specific)SDSProbe(Msc-specific)AMscTTCMscDWTtpd1MscPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–withinsituhybridizationInSituHybridization:VGD1cDNAasprobePlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–Subcellularlocalization(1)FusionProtein:VGD1Promoter-VGD1-GFP-TnosSub-cellularLocalizationofVGD1ProteinpgHpgIcpptcpcpcwcwI10μm10μmPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression

Studygeneexpression–Subcellularlocalization(1)FusionProtein:35SPromoter-SPL-GUS-Tnos雙螺旋如何雜交？DNASTAR(Lasergene)DNAEditMapDrawMegAlignPrimerSelectSeqManABCDHuaetal.,2009,Planta1.5kb1.0kbAMarkerBBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aBnaC.ALC.aBnaA.ALC.aHuaetal.,2009,PlantaBA12345Huaetal.,2009,PlantaABCHuaetal.,2009,PlantavalvevalvereplumvalvevalvereplumreplumvalvevalveDZCDBDZDZDZreplumAvalvevalveHuaetal.,2009,Planta981234567500bp700bpHuaetal.,2009,PlantaPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因轉錄本PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因表達的高通量分析主要方法1、DD（DifferentialDisplay）、cAFLP、SSH(SuppressionSubtractiveHybridization)2、SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression)3、MPSS(MassivelyParallelSignatureSequencing)4、基因芯片（Microarry）5、RAN-seqPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差異顯示分析(DD)實驗過程：1、分別從樣品與對照的相關組織中提取totalRNA。2、分離信使RNA，并合成cDNA文庫3、用隨即的oligoT引物來進行PCR擴增。4.、在polyacrylamide上進行分離5、克隆差異的電泳帶6、對差異的電泳帶進行測序。7、對差異進行注釋與對差異基因進行功能分析PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差異顯示分析(DD)的結果PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression基因差異顯示分析（cAFLP）cDNAPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionSSH:SuppressionSubtractiveHybridization通過PCR技術，專門擴增兩個樣品中表達不同的那部分基因要通過雜交與PCR兩個過程PCR的結果經過篩選，剔除假陽性信號試劑盒Clonetech公司銷售基因差異顯示分析-抑制性扣除雜交SSHPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression抑制性扣除雜交的結果（例）PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAarray）-尼龍膜上點樣用放射性物質標記探針，這是一種經濟的方法PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAMicroarray）-概況？原則上是在玻璃片、尼龍膜或其他材料上點上一系列的DNA片段，然后與不同的轉錄本探針進行雜交。這些有序排列的“點”可以是細菌克隆、純化后的質粒DNA、插入片段、或者是核苷酸片斷。點樣的密度可以達到每片10萬個多種高技術的有機組合PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片（DNAMicroarry）-幾種常見的技術高速的機器手在玻璃芯片上點樣，通常是點經過PCR擴增的cDNAs，所謂芯片的“印制”依賴高速機器手，點長片段的核苷酸技術）用所謂的照相平板印刷法，直接在芯片上合成25mer的多低聚核苷酸(AffymetrixGeneChips)用“鋁鏡”技術在芯片上直接合成25-70mers的低聚核苷酸(NimbleGeneChips技術)PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression低聚核苷酸芯片的分析過程代替芯片上的一個一個基因，低聚核苷酸芯片用的是低聚核苷酸（25-mers）制作過程用特殊的感光技術，如同用在半導體芯片上的一樣mRNA樣品分別地與芯片進行反應，而不是像在SpotArray中那樣成對地進行PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression低聚核苷酸芯片的制作過程1、一張被光照保護玻璃芯片上的基質，選擇性地接受光處理。2、透光部分被激活。3、單核苷酸為反應原料，經過溫育，受激活的基質發生化學反應，逐漸合成聚核苷酸。4、用其他光保護（罩子）處理。5、重復上述步驟延長核苷酸鏈。PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析過程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析過程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析過程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片的分析過程PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression電腦技術在生物芯片分析中的應用基因系列的選擇探針的設計掃描雜交結果圖像的分析芯片、樣本的標準化設定等基因的聚類分析：那些基因似乎在同一個代謝網絡Genome-wideanalysisofgeneexpressionDNA芯片

（Microarray）-實驗設計BiologicalQuestionSamplePreparationMicroarrayReactionMicroarrayDetectionDataAnalysis&ModelingPlantGenomicsforundergraduatestudentsPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression影響種子油分的積累環境因子環境光照溫度水分CO2濃度礦質養料栽培措施PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度響應QTL的發現sR6293b50.4cMCB10530b51.7cMO113G0554.6cMHG-FT-C258.8cMTapidorNIL-9NIL-1Ningyou-7LOD4123qocc2-2遺傳圖譜/QTL遺傳作圖與物理作圖遺傳作圖(Geneticmapping):利用遺傳學的原理與技術，在圖譜上顯示基因或者DNA序列特征的相對位置。物理作圖(Physicalmapping):。利用分子生物技術手段構建圖譜，在圖譜上直接精確地顯示基因或者其他DNA序列。遺傳圖地圖是通過一些顯著的標識（如河流、湖泊、山脈、道路、城市、單位、建筑物等）來顯示地理情況的。與此相似，遺傳圖也必須利用一些顯著的標識（稱為遺傳標記）來顯示基因組的組織結構。控制易于識別的質量性狀的主基因是首先被使用的遺傳標記。通過分析遺傳標記間的連鎖關系來構建遺傳圖重組率與遺傳圖距重組率（r）的計算式為：r=重組型/(親本型+重組型)如右圖例子：r=(76+75)/(542+537+76+75)=0.1228作圖函數：Haldane作圖函數r=[1–exp(–0.02D)]/2Kosambi作圖函數r=[1–exp(–0.04D)]/2[1+exp(–0.04D)]式中：D=兩基因間遺傳圖距圖距單位：1cM（厘摩）=1%重組率；100cM=1M厘摩是一個理論值，不是一個物理值如何作遺傳圖譜MAPMAKER:EricLander編程著名的遺傳圖繪制軟件。網址：/soft/mapmaker/300*500常見的作圖群體有DH群體，F2群體等遺傳標記根據遺傳多態性表現的水平，遺傳標記主要有以下幾種類型：形態標記：在形態性狀水平上表現出來的遺傳多態性，通過直接肉眼觀察或簡單的檢測即可識別，如花色的有無、植株的高矮、種子的形狀等。生化標記：在生化性狀或蛋白質水平上表現出來的遺傳多態性，必須通過生化分析加以識別。同工酶是最常用的生化標記。分子標記：DNA序列水平上表現出來的遺傳多態性，必須借助分子生物學手段加以識別。蔣立希，1991.中國油料第一期酵母中一些典型的生化標記酵母中常用一些營養缺陷和對有毒物質的抗性做為遺傳標記。可以通過在培養基中添加一些營養物質或有毒物質，對這些標記性狀加以識別。腺嘌呤刀豆氨酸環乙酰亞胺亮氨酸酵素尿嘧啶遺傳圖譜DNA分子標記的種類RFLP：RestrictionFragmentLengthPolymorphismsRAPD：RandomAmplifiedPolymorphicDNASSLP：SimpleSequenceLengthPolymorphismSNP：SingleNucleotidePolymorphismAFLP：AmplifiedFragmentLengthPolymorphismMicrosatellitesLandryetal,1991.Genome103個RFLP分子標記覆蓋了整個甘藍型油菜的基因組20多年前油菜遺傳圖譜與QTL定位的發展277個分子標記，平均密度是7.2cMQiuetal,2006.TAG12年前，前一個油菜973項目開始的時候！

油菜遺傳圖譜與QTL定位的發展Homozygouscombiningfavorablealleleson9QTLscanincreaseoilcontentfor9%Zhaoetal.,2012.

Theor.Appl.Genet.,124:407-421七八年以前，SG圖譜上的標記達到700個，局部的精細加密達到數十個KB油菜遺傳圖譜與QTL定位的發展全基因組關聯分析全基因組關聯分析（Genome-wideassociationstudy）是指在物種全基因組范圍內找出存在的序列變異，一般是最豐富的單核苷酸多態性（SNP），從中篩選出與某一個農藝或者品質性狀相關的SNPs。關聯分析是一種基于連鎖不平衡來識別分子標記之間或候選基因與性狀之間關系的方法。連鎖不平衡：連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)是指在某一群體中，不同座位上某兩個基因同時遺傳的頻率明顯高于預期的隨機頻率的現象。HLA不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的頻率出現。簡單地說，只要兩個基因不是完全獨立地遺傳，就會表現出某種程度的連鎖。這種情況就叫連鎖不平衡。連鎖不平衡可以是同一條染色體上的不同區域，也可以是不同染色體上的。物理作圖一系列相互重疊的克隆序列，跨越某染色體區域。FISH圖示（1）FISH在染色體上標記FISH在BAC上的標記FISH圖示（3）-人類第11號染色體PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度響應QTL的發現sR6293b50.4cMCB10530b51.7cMO113G0554.6cMHG-FT-C258.8cMTapidorNIL-9NIL-1Ningyou-7LOD4123qocc2-2遺傳圖譜/QTLPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度響應QTL的發現ABCDEABCDEABCDEABCDE202個DH株系PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression取每一代自由授粉種籽驗證含油量表型，結合分子標記輔助選擇回交親本，通過4代回交，獲得了含油量QTL-近等基因系群體，其中NIL1與NIL9的遺傳背景縮小到9cM的狹窄區域內，這兩個近等基因系對溫度具有不同的感應，種子含油量相差3個百分點。響應溫度的含油量近等基因系的構建42.60%39.65%NIL9NIL1PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度對種子油脂基因的影響NIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentTreatment1: Lowtemperature,21℃daytime;16℃innight

NIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentNIL9:HighoilcontentNIL1:LowoilcontentTreatment2: Normaltemperature,25℃daytime;18℃innight

Treatment3: Normaltemperature,29℃daytime;20℃innight

aRNAsaRNAsaRNAs提取成熟期種子的RNA進行基因表達差異分析。試圖找到究竟哪些基因對溫度感應的不同，從而種子油分積累產生差別的。Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度對種子油脂基因的影響Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionCombimatrixBrassica90Karray

所采用的芯片是加拿大PBI2008年春天研制出來的CombimatrixBrassica90Karray，這個芯片上的基因來自油菜的種子，一共有10萬多個點，986個blocks。整個實驗用了36張這樣的芯片。Zhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression三種溫度條件下近等基因系差異表達的

共性與特性T1T2T33963681864T1T2T3699295GlobalDEGsDEGsatqOC.C2.2

AB96781152815015248T2:25139(15.5%);T1:2933460(11.7%);T3:3499558(15.9%)Global39,QTL6,alwaysdifferentbetweenNILsZhuetal,2012,TAGPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpression溫度種子生長發育生物/非生物逆境光合體系代謝作用調控體系光吸收光合作用光化學調節受精胚發育脂肪酸蛋白質細菌重金屬HSP轉錄轉錄后信號傳導溫度調控種子含油量的途徑Zhuetal,2012,TAGEffectofhighnighttemperatureonseedoilcontentandfattyacidcompositionHighnighttemperaturepromotesseedoildecompositionGivenappropriatedaytimelightintensityandtemperature,thechangeofNTwouldchangetheefficiencyofphotosynthesis.Zhouetal2017,JXBTherapeseedcultivarsusedinthestudyJR:Oldcultivar,featuredwithrelativelylowSOC(35%),buthigherucicaicdcontent(30%)ZY:Newcultivar,featuredwithrelativelyhighSOC(50%),nearlyzeroerucicacid(0-5%)However,itisactuallynotyetexactlyknown,…toaddressthesequestions,wedidanexperimentwithtwolocalrapeseedcultivarsinsuchgrowthchambers.TowhatdegreehighNTcanreduceSOCinrapeseed?WhatthechangeofthetranscriptometoadapthighNTis?IfthereareanygenotypicdifferencesreactinghighNT?WhatastrategywecouldtaketoavoidtheSOCreduction?PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionJRZYGCB2JRZYZYJRJRZYGCB1Temperature(oC)ClocktimeFigure1PlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionFAcontent(μg/mg)LowNTHighNTJR******FAspeciesandtotalFAZY****C14:0C16:0C18:0C18:1C18:2C18:3C20:0C20:1C22:0C22:1C24:0→1%→0%0%→0%4%→4%5%→5%2%→1%3%→2%35%→33%57%→54%15%→16%20%→21%9%→10%10%→12%2%→1%1%→1%4%→4%1%→1%2%→2%1%→1%25%→27%2%→2%1%→1%1%→1%(JR)(ZY)LowNTJRhighNTJRlowNTZYhighNTZY(a)(b)(c)RelativeproportionsofFAspecies→Fromthecomparisonsabove,weclearlyseethathighNTcausedhightranscriptionallevelofthegenesontheglyoxylatecyclepathwayandplanthormonesignalpathwayinthesamplesharvestedat5:00.Therefore,ourinvestigationfurtherdeepenandnarrowdowntothegenesonthesetwopathways.Firstofall,wenoticedthegenesontheglyoxylatecyclepathwayarefeaturedwithcis-actingsiteGAGA-similarmotifabout1kbupstreamofstartcodon.ThemotifsaccordingtoresearchonDro’sophila,isconservativeforHEATSHOCKPROTEINgenes.So,wesupposethesegenesshouldalsorespondtoincreasingtemperature,asthehighNTelevatedtheexpressionallevelofthesegenes.Thecis-actingsiteGAGA-similarmotif1kbupstreamofthegenesonglyoxylatecycleGenesandtheirhomologsontheglyoxylatecyclepathwayPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionBnCTSBnLACS6BnACT1BnACX4BnMFP2BnAIM1BnKAT1BnPKT1BnECH2BnDCI1BnECI1BnRedBnHIBVHBnCGI58BnGA20ox1BnGA20ox5BnGA3ox3BnGA3ox4BnGA2ox1BnGA2ox2BnGA2ox3BnGA2ox4BnGA2ox6BnGA2ox7BnGA2ox8A/CE/GB/DF/HA/CE/GB/DF/HPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionGA3CK(H2O)PAC2013201420132014HZHZHZHZJHJHJHJH*****JRZY**(b)(a)Oilyield(kg/ha)TreatmentsPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgeneexpressionSAGE分析–圖示從特定組織中提取mRNA，通過反轉錄成為cDNA。通過限制酶切從每條cDNA得到一條長15bp的片段，稱為SAGE標簽。將來自各種cDNA上的標簽接成許多串聯復合體，并將其克隆。對這些克隆進行測序，然后統計各種標簽的數量。這樣就能了解各種mRNA的相對豐度。第二講基因組水平上基因功能研究及如何研究單個基因的功能2.1突變體庫的建設對基因功能研究的意義2.2反向遺傳學研究的手段2.3如何全面地研究單個基因的功能2.4蛋白組學ABC

Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents何為“正向遺傳學”與“反向遺傳學”傳統的遺傳學也稱為正向遺傳學，它是在已知基因功能的前提下，去尋找基因（序列）的，亦即“從功能到基因”。功能基因組學正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去尋找基因功能的，亦即“從基因到功能”，所以也稱為反向遺傳學。突變體表現型所牽涉的基因?基因序列基因的功能所帶來的表現?Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents正向遺傳學–從現象到基因序列T-DNA插入Ac/Ds轉座子插入圖位克隆（物理化學誘變）突變體庫基因克隆序列研究Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsIdentifymutantswithtraitofinterestRelatephenotypetogenotype4,6gseeds0,6gSeedsForwardGeneticsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsIdentifymutantsincandidategenesTestforphenotypiceffectofmutantgenotype4,6gseeds0,6gSeedsReverseGeneticsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents突變體庫對于遺傳學研究的意義隨著許多物種全基因組測序的完成，以及數據庫中現有的成百上千的ESTs序列，如何地來分析這些基因的功能、如何來理解基因與基因之間在生物體內的相互作用是一項重要的工作。基因功能的預測建立在與其他物種同源基因之間的比對，但許多基因的預測功能與他們實際的功能并不一致。還有許多的基因功能尚未歸類。突變體在研究基因的功能的過程中十分重要。Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents產生突變體庫的方法研究一個基因的功能，最可靠的方法是把一個基因的結構破壞掉，然后研究破壞后的表現型。借助大量的突變體，將會加速人們對這個物種基因功能的研究。兩種最常見的方法是：1、插入突變2、缺失突變3、物理化學誘變mutagenesisadvantagesdisadvantagesinsertionalT-DNA獲得旁翼序列geneticallymodifiedorganism(GMO)*transposonsFST,rapidlocalsaturation(e.g.twocomponentsystemAc/Ds)GMO,preferentialintegration“islands”不夠均衡retrotransposonsFST,preferentiallytargetinggenespace,non-GMO**TOS17,onlysystemdemonstratedinOryza

sativachemicalchromosome&pointmutations點突變隨機/未知/劑量/不利植物physical方法便利、點突變與大片段缺失隨機與未知*GMO:green-andscreen-house,publicacceptance**activatedthroughinvitrocultureandγ-rays(S.Nielen,2000)制造突變體的各類方法比較source:FAO,IAEAComprehensiveReviewinrice:Wangetal.MolecularPlant,6:596-604(2013)Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudentsGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突變插入突變作為研究基因組基因功能的有效手段，廣泛地應用于植物、哺乳動物的基因功能的研究。這個技術手段的優勢在于，插入片段的序列已知，并且攜帶容易識別的報告基因。其中，常用的插入突變技術有T-DNA插入突變Ac/Ds轉座子插入突變Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突變-擬南芥Ac/Ds基因或增強子捕獲系統Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突變–擬南芥Ac/Ds基因或增強子捕獲系統;;++++XDs(KanR);NAMSAc(NAMS)+;+++++;F1Ds(KanR)+++Ds(KanR);NAMSAc(NAMS)Ac(NAMS)Ds(KanR);NAMS

StartlinesScreeningforphenotypeand

GUSexpressionKanselectionF2F3TranspositionGerminate1000seeds,selectKanR+NAMRseedlingsonlyGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents插入突變–擬南芥Ac/Ds基因或增強子捕獲系統SET1003:EmbryosacSGT10019:PollengrainsSET1052:StyletissueSGT10003:EmbryonicroottipintorpedostageSGT10030:TrichomesandLateralrootsSET

1025:EggapparatuswithintheembryosacGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（從一個基因組中）全面地來研究一個基因？

Phenotyping:

過程中，要非常細心地觀察各自負責的突變體有別于野生型的性狀是什么，這部分工作叫Phenotyping。有些突變性狀諸如根長、根系特征、葉型、葉色、花色、花瓣數目、株高、分枝數目、莢果形狀、種子大小、種皮顏色等，肉眼直接看得出來；還有一些需要通過做切片，然后用各種顯微鏡（體視鏡、相差顯微鏡、稍描電鏡SEM、投射電鏡TEM、激光顯微鏡Confocal）觀察，比如花藥、胚珠的發育、種子內油體觀察、花粉管、葉綠體、線粒體等細胞器，無論肉眼是否看得出來，還是顯微鏡觀察，都要拍照，照片質量要高，清晰度、像素分辨率要一流的，最好還要有點藝術感（對一流雜志很重要！）Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（從一個基因組中）全面地來研究一個基因？2.Associationwiththegeneandphenotype：即你所觀察到的突變性狀是否由被T-DNA插入而遭破壞的那個基因位點引起的，關聯分析不外乎以下三種手段，好的雜志一般至少需要2種或2種以上的手段相互印證：等位變化：你的手頭在某個基因位點上擁有包括野生型在內的數個等位突變體，這些等位變化是否不同程度地引起某種突變性狀？這樣比較（特別是對于數量性狀）的前提是，等位突變體與野生型的遺傳背景高度一致，遺傳背景一致要通過不斷的回交來到達，一般要回交3代，單株系譜選擇；互補實驗：簡單地說就是從野生型中把某個基因克隆出來，再通過轉基因手段轉到突變體中去，看突變體是否能恢復到與野生型一樣，當然過程細節并不是那樣簡單；回復實驗：這個實驗適用Ac/Dc插入系統，簡單地講就是拿突變體與Ac親本進行雜交，看Ds跳開之后，突變性狀能否回復正常。Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（從一個基因組中）全面地來研究一個基因？3.Analysisofgeneexpression：你所研究的那個基因在什么發育階段或者在某個階段的哪種組織中表達，研究基因表達的手段有：RT-PCR與數量RT-PCR：PCR技術基礎上的表達分析有時不靠譜，因為采集組織的過程中只要有一點點污染，假陽信號會被PCR無限擴大；RNANorthernBlot：可以做到不同組織之間，無法更加精細地定位基因在局部區域的表達細節；RNA原位雜交：可以非常精細地定位到你的基因在哪幾層細胞內表達，非常有價值但技術水準要求很高的一種基因表達分析實驗；報告基因：通常把你的基因的啟動子序列與GUS或者GFP這樣的報告基因序列連在一起，然后轉化野生型，通過觀察GUS或者GFP熒光信號來確定你的基因在什么組織中表達，精細程度介于Northern與原位雜交之間。以上表達分析都是在RNA層面上的，在蛋白質層面上的表達研究更加可靠：WesternBlot：與NorthernBlot手段差不多，但探針是蛋白質抗體免疫金沉淀：也是原位雜交實驗，與RNA原位雜交區別在于探針是蛋白質抗體Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents如何（從一個基因組中）全面地來研究一個基因？4.Analysisofproteinfunction：如果你的基因編碼某種酶，你要從突變體中提取它并看看它催化某種底物反應的能力是否與野生型存在差別？如果你的基因編碼轉錄因子，通過分子構建做一個（帶報告基因）融合蛋白，看看融合蛋白是否真的可以定位到細胞核？如果你的基因是一個激酶或信號肽，看能否定位到細胞膜上？如果你的基因與呼吸作用相關，能否定位到線粒體中去？…………….如果你幸運的話，直接可以采用攜帶你的融合構建的質粒DNA轟擊洋蔥表皮細胞，在觀察洋蔥表皮細胞就可以了，如果不太幸運的話，必須通過轉基因的手段在轉基因株中觀察融合蛋白在哪里。比較高的境界是體外合成你的基因所編碼的蛋白，比如在酵母或者在大腸桿菌中合成你的蛋白，再把蛋白純化與底物反應，看看情況如何？

Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents擬南芥作為模式植物的優勢:種植密度大，每平方米可達500-2000株，世代短，僅2-3月.繁殖系數高：~2000粒/株雜交技術相對簡單基因組只有125MB轉基因技術已經十分成熟T-DNA或玉米轉座子Ac/Ds基因標示技術非常成功模式植物擬南芥在植物基因組學研究中不可替代的作用Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突變–基因功能研究–VGD1的研究過程1、突變體的發現WT(Ler)CDsdsqWT(Ler)vgd1ABsdsqvgd1Genome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突變–基因功能研究–VGD1的研究過程1、突變體的發現EFanstananGenome-wideanalysisofgenefunctionPlantGenomicsforundergraduatestudents例：插入突變–基因功能研究–VGD1的研究過程2、突變體性狀的遺傳分析Theresultshowedthatthemutationledtomalegametophytedefect,whichislinkedwithkanamycineselectivemarkerthatwasca