《流轉稅稅收業務咨詢及答復匯編（一）》（汕頭國稅）《流轉稅稅收業務咨詢及答復匯編（一）》（汕頭國稅）.........、xxx分局:為了使各基層征收單位能夠及時掌握納稅人普遍關心的稅收政策和業務疑難問題，我科對2006年9月份以來所有涉及流轉稅業務的網上咨詢問題及答復情況進行分類整理，挑選具有代表意義的50條問題匯編成《流轉稅稅收業務咨詢及答復匯編（一）》。現將匯編發送給你們，請你們及時組織本單位的人員學習，以提高基層稅務人員為納稅人提供咨詢服務的能力，使企業納稅中經常碰到的一些稅收問題能夠在基層消化，在一線得以解決。附件:1.流轉稅稅收業務咨詢及答復匯編（一）流轉稅稅收業務咨詢及答復匯編（一）自2006年9月25日汕頭國稅網站改版以來，我科收到納稅人稅收業務咨詢問題75條，目前，除個別問題因表述不清，無法答復之外，其他問題均已作詳細答復。為使基層征收單位能夠及時掌握納稅人普遍關心的稅收政策和業務疑難問題，我科根據市局局務會議的布置，對所有涉及流轉稅業務的網上咨詢問題及答復情況進行分類整理，挑選具有代表意義的50條問題匯編成冊，擬下發給各基層征收單位共同探討，以期共同提高。一、稅收政策：1、請教如何理解購進商品發生的“正常損失”和“非正常損失”,該損失對應的增值稅進項稅額在稅務處理上有何區別?答：《中華人民共和國增值稅暫行條例實施細則》第二十一條規定：非正常損失是指生產、經營過程中正常損耗外的損失，包括:(一)自然災害損失；(二)因管理不善造成貨物被盜竊、發生霉爛變質等損失；(三)其他非正常損失。此外，國家稅務總局在《關于企業改制中資產評估減值發生的流動資產損失進項稅額抵扣問題的批復》（國稅函〔2002〕1103號）中，對企業的“非正常損失”又作了進一步解釋，該批復指出：“非正常損失是指生產、經營過程中正常損耗之外的損失，對于企業由于資產評估減值而發生的流動資產損失，如果流動資產未丟失或損壞，只是由于市場發生變化，價格降低，價值量減少，則不屬于增值稅暫行條例實施細則中規定非正常損失，不作進項稅轉出處理。”。按照“非正常損失”的定義，區分正常損失和非正常損失的關鍵是看損失是否屬于生產、經營過程中的正常損耗。如果屬于正常損耗，則不作進項稅額轉出處理；如果屬于非正常損失，則應將該項購進商品的進項稅額從當期發生的進項稅額中扣減。2、我司擬轉讓一固定資產,而且轉讓的價值比原值高,請問轉讓該固定資產應納什么稅?答：根據《財政部、國家稅務總局關于舊貨和舊機動車增值稅政策的通知》（財稅[2002]29號）規定，納稅人銷售自己使用過的應稅固定資產，無論其是增值稅一般納稅人或小規模納稅人，一律按4%的征收率減半征收增值稅，不得抵扣進項稅額。3、我是一戶家具生產企業,產品100%出口,所用原材料大部份在農民生產者購進,但本縣沒有那么多原木可收購,因此我廠只有在外縣進行收購,且用現金支付,有些稅務人員說這樣屬于異地收購,不能抵扣進項稅額。像這種情況,我廠收購的原木能否申報抵扣稅款?答：按照現行規定，納稅人不得擅自攜帶收購發票跨市、縣使用。從你司反映的情況看，屬于未按規定開具收購發票，已開具的收購發票不得作為抵扣憑證。如果納稅人發生異地收購業務，應當依照固定業戶臨時外出經營的有關稅收規定處理，向產地稅務機關申請領購和使用收購發票，開具的收購發票在經主管稅務機關審核后可作為抵扣憑證。4、我有兩個問題想咨詢一下：（1）主管稅務局要求所有購銷業務都需簽訂購銷合同，請問該政策是汕頭的規定還是稅務總局的規定？（2）我單位銷售貨物給一家公司，而貨款均從其子公司（獨立法人）回款，這樣做是否違反國家法規？答：（1）按《中華人民共和國稅收征收管理法》第一章第六條第二款規定：納稅人、扣繳義務人和其他有關單位應當按照國家有關規定向稅務機關提供與納稅和代扣扣繳、代收代繳稅款有關的信息。因此各級主管稅務機關有權根據有關規定，在納稅人辦理有關涉稅業務時，要求納稅人提供相關附送資料（包括購銷合同）。（2）你單位銷售貨物給一家公司，而貨款均從其子公司（獨立法人）回款的情形，屬銷售行為中的“票、貨、款”不一致，存在較大涉稅疑點，主管稅務機關有權對你單位的銷售行為的真實性進行核實。5、我公司1998年被稅務機關認定增值稅臨時一般納稅人,由于當時年銷售額在標準以下,被稅務機關取消臨時一般納稅人資格。當時我公司在國外進口木材價值一百多萬元一直未能銷售。2004年我公司又重新申請認定增值稅一般納稅人,經營范圍已變更,現我公司準備將原有進口木材降價處理,請問稅率是按17%還是6%？答：根據《中華人民共和國增值稅暫行條例》的規定，增值稅一般納稅人銷售貨物,按貨物適用稅率計算征收增值稅。你司屬于增值稅一般納稅人，銷售存貨應當按照17%或13%的法定稅率計算征收增值稅,不能按小規模納稅人適用的征收率計算征收增值稅。6、我想請問一下，我公司是一家工業生產企業，屬于一般納稅人，因電力局開給我司的電費是一張增值稅發票，但是電費中有一部為管理用電，一部份為生產用電，請問一下這一張增值稅發票是否可以全部抵扣？答：按照《中華人民共和國增值稅暫行條例》的規定，下列項目的進項稅額不得從銷項稅額中抵扣：（一）購進固定資產；（二）用于非應稅項目的購進貨物或者應稅勞務；（三）用于免稅項目的購進貨物或者應稅勞務；（四）用于集體福利或者個人消費的購進貨物或者應稅勞務；（五）非正常損失的購進貨物；（六）非正常損失的在產品，產成品所耗用的購進貨物或者應稅勞務。你司在生產經營中所耗用的電力，如果不屬于以上不予抵扣項目的范圍，可按取得的增值稅專用發票上注明的稅款全額抵扣進項稅額。7、有一家企業要開展農產品收購業務,須在異地開展收購業務,但由于農產品收購業務比較難以控制,故異地的國稅局不同意銷售收購發票給企業,這樣企業就根本不能開展正常業務工作,請問:這種情況下企業該如何做?答：根據《中華人民共和國稅收征收管理法實施細則》第二十一條規定和廣東省國家稅務局《關于加強我省農業產品收購業務增值稅管理有關問題的通知》（粵國稅發[2003]22號）第五點的規定，從事生產、經營的納稅人到外縣（市）臨時從事生產、經營活動的，應當持稅務登記證副本和所在地稅務機關填開的外出經營活動稅收管理證明，向營業地稅務機關報驗登記，接受稅務管理。從事生產、經營的納稅人外出經營，在同一地累計超過180天的，應當在營業地辦理稅務登記手續。收購企業到異地收購農業產品增值稅的管理比照固定業戶臨時外出經營的有關稅收規定處理。8、我行及汕頭紳達拍賣行、汕頭經濟特區物資拍賣行有限公司、廣東鳳凰拍賣有限公司、廣東博晟拍賣行有限公司五家拍賣機構于二○○六年九月十一日接受汕頭市中級人民法院（2006）汕中法執一字第76、77、78號）委托，聯合拍賣汕頭海洋第一聚苯樹脂有限公司的房產、土地使用權及機器設備。該宗拍賣標的物已于二○○六年十一月二十日，在汕頭紳達拍賣行拍賣廳舉行的拍賣會上拍賣成交，買受單位為愛思開聚苯樹脂（汕頭）有限公司（該公司系韓國SK集團在汕設立重組汕頭海洋第一聚苯樹脂有限公司的企業）。成交總金額人民幣24000萬元。其中機器設備聚苯樹脂生產線3條，成交金額為人民幣75774060元。按規定，我行需向買受人開具《廣東省商品銷售統一發票》，五家拍賣機構均攤各五分之一，開票金額為15154812元，請示該項開票額適應稅率為多少及計算方法？答：你好，根據《國家稅務總局關于拍賣行取得的拍賣收入征收增值稅、營業稅有關問題的通知》（國稅發[1999]40號）的規定，對拍賣行受托拍賣增值稅應稅貨物，向買方收取的全部價款和價外費用，應當按照4%的征收率征收增值稅。你行受托拍賣汕頭海洋第一聚苯樹脂有限公司的應稅貨物，應當按貨物的拍賣價款及向買受方收取的手續費合并開出銷售發票，并按4%的征收率征收增值稅。9、請問xx服裝貿易公司自己購主料委托其他加工廠加工成成品,對xx服裝貿易公司來講,應交商業增值稅還是工業企業增值稅?另電腦公司網絡工程安裝業務該交增值稅還是營業稅?答：從反映的情況看，XX服裝貿易公司實際是委托加工企業，委托加工業務發生時，受托加工貨物的工廠為納稅義務人，應按收取的加工費計算繳納增值稅。XX服裝貿易公司銷售委托加工收回的商品，屬于商業行為，應按規定繳款增值稅。電腦公司從事網絡工程安裝業務收取的工程安裝費，屬于營業稅征收范圍，具體業務問題請咨詢當地主管地稅部門。10、你好!請問個體戶商業征收率為4%,如果銷售額達到180萬,征收率是不是17%？答：根據《中華人民共和國增值稅暫行條例》、及《增值稅一般納稅人申請認定辦法》規定，對年應稅銷售額達到或超過小規模納稅人標準（工業100萬元，商業180萬元）的企業（含個體經營者），均可認定為增值稅一般納稅人；個體經營者會計核算健全，即能按會計制度和稅務機關的要求準確核算銷項稅額、進項稅額和應納稅額，可以認定為一般納稅人。你單位是個體戶，如符合一般納稅人標準的，可申請認定為一般納稅人，經稅務機關審核后，符合一般納稅人條件的，可以認定為一般納稅人，并應按適用稅率（13%或17%）征稅。二、發票管理：1、我公司在本月開給客戶的增值稅專用發票由于在投遞過程中丟失發票的第一、第二聯。此份發票我公司并未申報，請問我公司應怎樣處理？要處罰嗎？是多少？答：你司丟失已開具的增值稅專用發票的發票聯和抵扣聯，應當按規定程序向當地主管稅務機關和公安機關報失，并在《中國稅務報》刊登“遺失聲明”。丟失增值稅專用發票的行為屬于未按照規定保管發票，主管稅務機關必須按照《中華人民共和國稅收征收管理法》和《中華人民共和國發票管理辦法》的規定，責令限期改正，可以并處一萬元以下的罰款。對于丟失聯次的增值稅專用發票，你司必須在納稅申報期內向主管稅務機關申報納稅，并按《增值稅專用發票使用規定》第二十八條的規定，提供相應專用發票記賬聯復印件給購貨方，由購買方持該復印件到主管稅務機關進行認證，認證相符的，憑該專用發票記賬聯復印件及銷售方所在地主管稅務機關出具的《丟失增值稅專用發票已報稅證明單》，經購買方主管稅務機關審核同意后，可作為增值稅進項稅額的抵扣憑證。2、請問增值稅專用發票自購票之日開始,可以使用的期限是多久?答：對于防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，目前沒有使用期限的相關規定。3、我想咨詢一下，購貨方是事業局的，我們要求他們提供稅務登記號等各項信息來開票。但購貨方說他們是屬于事業單位沒有國稅稅務登記號。這樣的情況，我們應該要怎么開具發票？答：根據《中華人民共和國發票管理辦法》的規定，發票的填開必須項目齊全。對于增值稅普通發票，如購貨方為個人的，可以只填寫購貨方名稱，購貨方識別號、開戶行等信息可以不填。4、我公司是輔導期納稅人，于20**年2月6日購買增值稅專用發票，請問專用發票的使用期限是多少天？答：根據《國家稅務總局關于加強新辦商貿企業增值稅征收管理有關問題的緊急通知》（國稅發［2004］37號）,輔導期一般納稅人每月領購的專用發票在月末尚未使用的，主管稅務機關在次月發售專用發票時，應當按照上月未使用專用發票份數相應核減其次月專用發票供應數量。你司2006年2月6日購買的增值稅專用發票，如果在當月未使用完，主管稅務機關將按規定核減你司在次月的購票數量。對于防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，目前沒有使用期限的相關規定。5、我們去年12月開出的普通發票客戶退回要求重新開具,理由是去年的發票他們今年不能做帳,我們已經去問了金平分局發票核銷處,他說這個理由不可以開具普通紅字發票,我想問問開具普通發票的紅字發票是不是一定要經過審核批準后才能開具?答：根據《廣東省國家稅務局關于開具紅字普通發票有關問題的通知》規定：（一）凡發生銷貨折讓或退回，能取回原發票的，如果銷貨方未作帳務處理，可將收回的發票聯粘附在存根聯后面依次注明“作廢”。屬于銷售折讓的，應按折讓后的貨款重新開具銷售發票給購貨方，不得開具紅字發票；如果銷貨方已作帳務處理，可開具相同內容的紅字發票以紅字發票記帳聯作為抵減當期的銷售收入。同時，將收回的發票聯粘附在紅字發票的存根聯上。(二)發生銷貨折讓或退回，無法取回原發票需要開具紅字普通發票的，銷貨方必須取得對方主管稅務機關的有效證明。即由購買方寫出進貨退回或折讓的有關書面材料交由主管稅務機關加具意見并蓋章后送交銷貨方，才能作為銷貨方開具紅字普通發票的合法依據，否則，銷貨方不得抵減當期的銷售收入。6、一臺片材機28萬元，開3套增值稅專用發票，每套數量都填“1/3”可以嗎？如果不對，請教，應該如何填？答：對于這種情況，你司可持有關資料向主管稅務機關申請變更防偽稅控開票系統最高開票限額，提高開票限額，以滿足公司日常經營需要。7、我司于1月份銷售一批自產產品給一家出口貿易公司,開具增值稅專用發票1套,但由于該批貨物不合格,對方拒絕收貨,把貨物連同發票退回我司,但該發票對方已到當地稅務機關認證(未蓋認證章/對方認證的目的是發票的真偽),請問這張發票可以作廢嗎?需要同當地稅務征管闡明原因嗎?答：根據《增值稅專用發票使用規定》（國稅發[2006]156號）的規定，開具專用發票后發生銷貨退回的，如果符合作廢條件，則可以在發票全部聯次收到后直接作廢；如不符合作廢條件，則需由購貨方向其主管稅務機關申請，并由購貨方主管稅務機關出具加蓋主管稅務機關印章的《開具紅字增值稅專用發票通知單》，銷貨方憑《開具紅字增值稅專用發票通知單》開具紅字專用發票。同時具有下列情形的，為規定所稱作廢條件：（一）收到退回的發票聯、抵扣聯時間未超過銷售方開票當月；（二）銷售方未抄稅并且未記賬；（三）購買方未認證或者認證結果為“納稅人識別號認證不符”、“專用發票代碼、號碼認證不符”。根據你司的情況，該發票不符合作廢條件，不能直接作廢。8、請問銷貨方開具的增值稅專用發票在郵寄途中出現問題,我司沒有收到。由于金額較小(幾千元),如果我司不用于抵扣,可否用銷貨方提供的記帳聯復印件加公司證明入帳用以商品成本?答：《增值稅專用發票使用規定》第二十八條規定：一般納稅人丟失已開具專用發票的發票聯和抵扣聯，如果丟失前已認證相符的，購買方憑銷售方提供的相應專用發票記賬聯復印件及銷售方所在地主管稅務機關出具的《丟失增值稅專用發票已報稅證明單》，經購買方主管稅務機關審核同意后，可作為增值稅進項稅額的抵扣憑證；如果丟失前未認證的，購買方憑銷售方提供的相應專用發票記賬聯復印件到主管稅務機關進行認證，認證相符的憑該專用發票記賬聯復印件及銷售方所在地主管稅務機關出具的《丟失增值稅專用發票已報稅證明單》，經購買方主管稅務機關審核同意后，可作為增值稅進項稅額的抵扣憑證。對是否可用銷貨方提供的記帳聯復印件加公司證明入賬，請按現行會計制度規定處理。9、我司有一家供應商(A)在汕頭,采用先付訂金方式交易,我司在今年9月份付訂金1筆5萬元,從我公司賬戶轉出,但轉進供應商(A)的賬戶開票資料上顯示的工商銀行賬戶,而是供應商(A)在中國建設銀行開設的對公賬戶,12月份收到供應商(A)發到我司貨物,請問我司現在可以要求供應商(A)開增值稅票嗎?答：根據《中華人民共和國稅收征收管理法》第二十一條規定：單位、個人在購銷商品、提供或者接受經營服務以及從事其他經營活動中，應當按照規定開具、使用、取得發票。因此，你司應當要求供應商開具增值稅專用發票或增值稅普通發票，供應商開具的發票應當項目齊全、與實際交易相符，對不符合要求的發票，你司可退回并要求對方重新開具真實、完整、正確的發票。10、收到北京某單位開出的增值稅專用發票的《銷售貨物或提供應稅勞務清單》是人工填寫的,是否符合規定？答：根據《增值稅專用發票使用規定》第十二條規定：一般納稅人銷售貨物或提供應稅勞務可匯總開具專用發票。匯總開具專用發票的，同時使用防偽稅控系統開具《銷售貨物或提供應稅勞務清單》，并加蓋財務專用章或發票專用章。因此，你單位取得的手工填寫的《銷售貨物或提供應稅勞務清單》不符合規定，不能抵扣進項稅額。11、企業變更為一般納稅人,第一次申領增值稅發票需要提交哪些資料？答：企業變更為一般納稅人，第一次申領增值稅發票，納稅人應提交如下資料；1、《稅務行政許可申請表》；2、申請開具最高開票限額增值稅專用發票的書面報告；3、《稅務登記證》副本；4、《增值稅防偽稅控最高開票限額申請表》；5、增值稅一般納稅人營業執照復印件；6、法人、經辦人身份證復印件；7、企業所在地主管稅務機關要求的其他表格及資料（具體可向企業所在地主管稅務機關的辦稅服務廳咨詢）。12、我是從農民收購農產品賣給超市的個體戶，由于業務的需要，超市需要我提供收購發票，請問如何向稅局申請開這種發票？答：你所反映的經營情況，屬增值稅應稅行為，應依法向稅務機關申報納稅；同時，你如屬已辦理稅務登記的個體戶，可向主管稅務機關申請購買并使用普通發票。13、我是花木種植農戶，產品銷往超市，超市要求我出具農產品收購發票，請問如何申請代開？答：農業生產者銷售的自產農業產品免征增值稅。超市向農業生產者收購農業產品，可以直接向主管稅務機關申請領購和使用收購發票。三、防偽稅控系統管理：1、請問我司要設臨時展點約1-2個月，現已是一機多票，沒有手工普通發票，像我司這樣情況可以申請分機開票嗎？申請分機開票需要什么手續？答：從你司反映的情況來看，是可以申購分開票機的，請直接向主管稅務機關申請辦理。2、請問增值稅專用發票的收款人及復核都必須在稅控機里打印出來而不能蓋章是嗎？收款人及復核這兩項用蓋章就不能認證是嗎？答：《中華人民共和國發票管理辦法》第二十三條規定：開具發票應當按照規定的時限、順序，逐欄、全部聯次一次性如實開具，并加蓋單位財務印章或者發票專用章。按照上述規定，納稅人在防偽稅控系統開具增值稅專用發票時，應當根據規定全部欄目一次性開具，包括收款人、復核人和開票人。3、我單位收到一份電腦版廣東省商品銷售統一發票,因對方所屬龍湖區外砂鎮稅局,還未實行稅控機一機多票開票系統,未能開出增值稅普通發票,請問屬實嗎?答：根據《廣東省國家稅務局關于增值稅普通發票使用問題的通知》（粵國稅函〔20**〕23號），從20**年2月1日起，凡納入防偽稅控“一機多票”系統的增值稅一般納稅人(商業零售企業和水、電、氣企業除外),其商品銷售、加工修理修配業務一律通過防偽稅控開票系統開具增值稅普通發票。對于除增值稅一般納稅人之外的其他企業，目前并沒有強制要求通過防偽稅控開票系統開具增值稅普通發票，你單位收到的電腦版廣東省商品銷售統一發票是否真實，可向主管稅務機關申請鑒定真偽。四、進項稅額管理：1、申報抵扣進項稅額時，是否需附上付款憑證及入庫單？答：目前，增值稅抵扣憑證包括增值稅專用發票、農產品收購發票、廢舊物資銷售發票、海關代征進口增值稅專用繳款書和貨物運輸業發票等五類。不同的抵扣憑證在申報抵扣進項稅額時都有具體規定：（1）增值稅專用發票和貨物運費業發票：按現行規定，付款憑證及入庫單并不作為申報抵扣進項稅額的必送資料。（2）農產品收購發票：根據《關于加強我省農業產品收購業務增值稅管理有關問題的通知》（粵國稅發[2003]22號）規定，主管稅務機關對收購發票進行審核抵扣時，當期抵扣金額較大的，應要求一般納稅人收購企業附上過磅單、入庫單和有銷貨人簽收的付款憑證等，對貨物交易的真實性有疑問的，須查證后方可抵扣進項稅額。（3）廢舊物資銷售發票：根據《關于印發<廣東省廢舊物資回收經營單位增值稅管理暫行規定>的通知》（粵國稅發[2003]21號）規定，對納稅人當期取得廢舊物資銷售發票的抵扣金額較大的，可要求企業提供過磅單、入庫單、運費單據、付款憑證等。凡對購銷行為的真實性存在疑問的，待查證后才予以抵扣。（4）海關代征進口增值稅專用繳款書：根據《國家稅務總局關于加強商貿企業增值稅納稅評估工作的通知》（國稅發【2001】140號）的規定，有自營進口業務的商貿企業須報送對外貿易經濟合作部門關于賦予其進口經營權的批準文件的復印件（以下簡稱進口經營權批件），否則，其取得的海關增值稅完稅憑證不得作為增值稅扣稅憑證。有自營進出口業務或委托代理進出口業務的商貿企業，須在簽訂進口合同后五日內報送合同復印件，未按期報送合同復印件的，其相關進口貨物的海關增值稅完稅憑證不得作為扣稅憑證。此外，主管稅務機關在審核納稅人申報的增值稅抵扣憑證時，認為存在疑點的，可要求納稅人提供包括入庫單、付款憑證在內的相關資料。2、進料加工內銷打稅，與海關磋商的海關完稅憑證價格與進口報關單價格有差額，比其高很多，完稅憑證還能作進項抵扣嗎？依據是什么？答：關于企業咨詢的進料加工完稅憑證抵扣問題，進料加工業務進口料件屬保稅進口貨物，一般情況下是不能在國內銷售的，如因特殊原因須轉在國內銷售的，必須經過海關、外經貿等部門同意批準后辦理相關核準手續；進口料件在國內銷售后，必須在實現銷售收入辦理納稅申報時按照完稅憑證所列進項稅額予以抵扣。3、我單位進口商品然后銷售給深圳一單位,商品在深圳報關,然后由深圳運輸公司拉貨到深圳一企業,請問運輸公司開給我單位的運輸發票能否做進項抵扣,符合什么條件的運輸發票才可抵稅?答：增值稅一般納稅人外購貨物（固定資產除外）和銷售應稅貨物所取得的由自開票納稅人或代開票單位為代開票納稅人開具的貨物運輸業發票準予抵扣進項稅額。這里所指的運輸發票是指運輸單位提供運輸勞務自行開具的運輸發票，或運輸單位主管地方稅務局及省級地方稅務局委托的代開發票中介機構為運輸單位和個人代開的運輸發票,對于其他單位代運輸單位和個人開具的運輸發票一律不得抵扣。你單位銷售進口商品而支付的運輸費用,如果取得合法真實的貨物運輸業發票,可按運輸費用7%的扣除率計算進項稅額。4、您好!我單位為一進口內銷企業,一般納稅人,每月取得的進口關稅及增值稅進項票應在月底前拿到稅局認證?整個納稅申報過程該如何進行及該帶什么資料?請詳細給我解答。答：根據《國家稅務總局關于加強海關進口增值稅專用繳款書和廢舊物資發票管理有關問題的通知》（國稅函〔2004〕128號）規定：增值稅一般納稅人取得的2004年2月1日以后開具的海關完稅憑證，應當在開具之日起90天后的第一個納稅申報期結束以前向主管稅務機關申報抵扣，愈期不得抵扣進項稅額；同時，按照《國家稅務總局關于加強商貿企業增值稅納稅評估工作的通知》（國稅發【2001】140號），從2002年2月1日起，有自營進口業務的商貿企業須報送對外貿易經濟合作部門關于賦予其進口經營權的批準文件的復印件（以下簡稱進口經營權批件）；否則，其取得的海關增值稅完稅憑證不得作為增值稅扣稅憑證。有自營進出口業務或委托代理進出口業務的商貿企業，須在簽定進口合同后五日內報送合同復印件。未按期報送合同復印件的，其相關進口貨物的海關增值稅完稅憑證不得作為扣稅憑證。根據《國家稅務總局關于增值稅一般納稅人取得防偽稅控系統開具的增值稅專用發票進項稅額抵扣問題的通知》（國稅發[2003]17號）規定：增值稅一般納稅人申請抵扣的防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，必須自該專用發票開具之日起90日內到稅務機關認證，否則不予抵扣進項稅額。認證通過的防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，應在認證通過的當月按照增值稅有關規定核算當期進項稅額并申報抵扣，否則不予抵扣進項稅額。因此，你司應在上述規定的期限內申報認證抵扣。同時，按照《增值稅一般納稅人納稅申報“一窗式”管理操作規程》的規定，在辦理增值稅納稅申報時，應提供以下資料：（一）《增值稅納稅申報表（適用于增值稅一般納稅人）》及《增值稅納稅申報表附列資料（表一）、（表二）》。（二）《資產負債表》和《損益表》。（三）稅控IC卡（使用小容量稅控IC卡的企業還需要持有報稅數據軟盤）。（四）加蓋開戶銀行“轉訖”或“現金收訖”章的《中華人民共和國稅收通用繳款書》或經主管稅務機關受理的延期繳納稅款文書。（五）《成品油購銷存情況明細表》和加油IC卡、《成品油購銷存數量明細表》。（六）《增值稅運輸發票抵扣清單》。（七）《海關完稅憑證抵扣清單》。（八）《廢舊物資發票開具清單》。（九）《廢舊物資發票抵扣清單》。（十）《代開發票抵扣清單》（十一）主管稅務機關要求報送的其他資料。以上第（一）、（二）項為所有納稅人必報資料。除此之外，納入防偽稅控系統管理的納稅人須報送第（三）項資料；未實行“稅庫銀聯網”且當期有應納稅款的納稅人須報送第（四）項資料；第（五）至（十一）項為當期發生該項業務的納稅人必報資料。5、我公司在12月認證了一些增值稅專用發票，可不可以留在1月份申報抵扣?答：根據《國家稅務總局關于增值稅一般納稅人取得防偽稅控系統開具的增值稅專用發票進項稅額抵扣問題的通知》（國稅發[2003]17號）規定，增值稅一般納稅人申請抵扣的防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，必須自該專用發票開具之日起90日內到稅務機關認證，認證通過的防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，應在認證通過的當月按照增值稅有關規定核算當其進項稅額并申報抵扣，否則不予抵扣進項稅額。因此，你單位12月份認證的進項發票，應在12月（稅款所屬期）當月申報抵扣。6、申請一般納稅人資格后需要購買防偽稅控開票系統,請問購買該機的發票是否可以抵扣?賬務如何處理?答：根據《國家稅務總局關于推行增值稅防偽稅控系統若干問題的通知》（國稅發[2000]183號），自2000年1月1日起，企業購置增值稅防偽稅控系統專用設備和通用設備發生的費用，準予在當期計算繳納所得稅前一次性列支；同時可憑購貨所取得的專用發票所注明的稅額從增值稅銷項稅額中抵扣。增值稅防偽稅控系統專用設備包括稅控金稅卡、稅控IC卡和讀卡器；通用設備包括用于防偽稅控系統開具專用發票的計算機和打印機。帳務處理按照專用發票上注明的增值稅額，借記“應交稅金——應交增值稅（進項稅額）”科目。7、我公司是輔導期一般納稅人，為什么申報的抵扣憑證總得一個月后，稅務部門才通知可以抵扣稅額？答：根據《國家稅務總局關于加強新辦商貿企業增值稅征收管理有關問題的緊急通知》（國稅發明電[2004]37號）規定：在輔導期內，商貿企業取得的專用發票抵扣聯、海關進口增值稅專用繳款書和廢舊物資普通發票以及貨物運輸發票要在交叉稽核比對無誤后，方可予以抵扣。按照目前稽核比對的程序，納稅人申報的抵扣憑證一般得在次月才能接收到比對結果。如果你司屬于輔導期一般納稅人，按上述規定和程序，當月申報的抵扣憑證必須在以后月份收到稽核比對結果后方可抵扣增值稅款。8、增值稅專用發票的抵扣有時限規定嗎？多久就要抵扣？答：《國家稅務總局關于增值稅一般納稅人取得防偽稅控系統開具的增值稅專用發票進項稅額抵扣問題的通知》（國稅發[2003]17號）規定：增值稅一般納稅人申請抵扣的防偽稅控系統開具的增值稅專用發票，必須自該專用發票開具之日起90日內到稅務機關認證，并在認證通過的當月按照增值稅有關規定核算當期進項稅額并申報抵扣，否則不予抵扣進項稅額。9、你好！公司是一般納稅人，在實行進項抵扣的時候，有一張進項發票已超過90天過了期限，現在我公司打算不把這張進項發票進行抵扣只單獨作為購入原材料的合法憑證，請問這樣做可不可以？如果可以，這筆分錄該怎么做？答：1、進項發票是購入原材料的合法憑證。2、對購進貨物取得的抵扣聯的認證、申報和會計處理，可按如下方法處理。凡購進貨物并收到防偽稅控開具的抵扣聯，借：原材料等應交稅金——應交增值稅（進項稅額）貸：銀行存款等對該份抵扣聯，如在規定期限通過認證的，對上述會計處理不需變動，并在通過認證的月份申報抵扣；如在規定期限進行認證，但通不過認證的，或者超過規定期限不進行認證的，則需對進項稅額作轉出處理：借：原材料等貸：應交稅金——應交增值稅（進項稅額轉出）五、納稅申報管理：1、我司是出口貿易企業，月底報關出口貨物一批，工廠因為的發票權限問題，增值稅發票無法在月底開出，只能在次月納稅申報后購買發票后才能開給我司。但我司的銷售收入是計算在本月，而發票只能次月才入賬，請問，這樣可以嗎？答：如果企業在購進貨物后沒有取得發票的，可以將購進貨物暫估入賬，待取得發票后紅字沖減，再按照取得發票記賬。2、一戶輔導期一般納稅人企業增購發票時,出現預繳稅款,在次月申報時在申報表如何反映或計算?答：輔導期一般納稅人增購專用發票預繳的稅款，在次月申報時直接填報在申報表第28欄“分次預繳稅額”的本月數上。電子申報軟件會根據應納稅額和預繳稅額自動計算出當期實際應繳的稅額。3、我司是一家一般納稅人的生產企業，因產品質量要求較嚴，其發出的商品需等購買方驗收及檢驗合格后才能確認銷售，對此我司對發出的商品先放在發出商品科目，等購方檢驗合格后才開出發票確認銷售，這樣做是否準確，有沒有違反稅法規定？答：《中華人民共和國增值稅暫行條例實施細則》規定：銷售貨物或者應稅勞務的納稅義務發生時間，按銷售結算方式的不同，具體為：（一）采取直接收款方式銷售貨物，不論貨物是否發出，均為收到銷售額或取得索取銷售額的憑據，并將提貨單交給買方的當天；（二）采取托收承付和委托銀行收款方式銷售貨物，為發出貨物并辦妥托收手續的當天；（三）采取賒銷和分期收款方式銷售貨物，為按合同約定的收款日期的當天；（四）采取預收貨款方式銷售貨物，為貨物發出的當天；（五）委托其他納稅人代銷貨物，為收到代銷單位銷售的代銷清單的當天；（六）銷售應稅勞務，為提供勞務同時收訖銷售額或取得索取銷售額的憑據的當天；（七）納稅人發生本細則第四條第（三）項至第（八）項所列視同銷售貨物行為，為貨物移送的當天。你司采取的銷售結算方式如果符合上述規定，則應該按照上述規定確定納稅義務發生時間和開具增值稅發票；如果你司采取其他銷售結算方式，則應該按照《企業會計準則》確認商品所有權實現轉移的規定作為納稅義務發生時間。六、資格認定管理：1、我公司是一家從事花卉種植、經銷的企業，能否申請增值稅一般納稅人，如何收稅？答：根據《中華人民共和國增值稅暫行條例》的規定：農業生產者銷售的自產農業產品免征增值稅。如果你司全部銷售免稅農產品，按規定不得開具增值稅專用發票，可不辦理一般納稅人認定手續。2、新成立的公司想申請一般納稅人是不是一定要做夠180萬才能申請？以前好像是3個月內申請就行，我公司有進出口權。答：根據國家稅務總局關于加強新辦商貿企業增值稅征收管理有關問題的補充通知（國稅發明電[2004]62號）的規定：對新辦小型商貿批發企業中只從事貨物出口貿易，不需要使用專用發票的企業（以下簡稱出口企業），為解決出口退稅問題提出一般納稅人資格認定申請的，經主管稅務機關案頭審核、法定代表人約談和實地查驗，符合企業設立的有關規定，并有購銷合同或書面意向，有明確的貨物購銷渠道（供貨企業證明），可給予其增值稅一般納稅人資格，但不發售增值稅防偽稅控開票系統和增值稅專用發票。以后企業若要經營進口業務或內貿業務要求使用專用發票，則需重新申請，主管稅務機關審核后按有關規定辦理。你司有進出口權，可直接向主管稅務機關申請增值稅一般納稅人認定，但不能領購增值稅專用發票。3、我司剛轉正為一般納稅人，因我司是純出口企業,故在輔導期間不能提供稅控防偽系統和增值稅發票。現我司近期打算開展內銷業務,需使用增值稅發票,請問如何申購稅控機和增值稅發票?是否去辦稅服務廳行政許可受理窗口申請?此期間若需開具增值稅發票，是否可到稅務機關申請代開,稅率是否是17%?申請代開的手續如何辦理?答：根據《國家稅務總局關于加強新辦商貿企業增值稅征收管理有關問題的補充通知》（國稅發明電[2004]62號）的規定：對新辦小型商貿批發企業中只從事貨物出口貿易，不需要使用專用發票的企業（以下簡稱出口企業），為解決出口退稅問題提出一般納稅人資格認定申請的，經主管稅務機關案頭審核、法定代表人約談和實地查驗，符合企業設立的有關規定，并有購銷合同或書面意向，有明確的貨物購銷渠道（供貨企業證明），可給予其增值稅一般納稅人資格，但不發售增值稅防偽稅控開票系統和增值稅專用發票。以后企業若要經營進口業務或內貿業務要求使用專用發票，則需重新申請，主管稅務機關審核后按有關規定辦理。你司計劃開展內銷業務，需要申購增值稅專用發票，可向主管稅務機關申請，經主管稅務機關批準后，納入輔導期一般納稅人管理，使用防偽稅控開票系統和增值稅專用發票。對于你司在申請領購增值稅專用發票期間如需要開具增值稅專用發票的問題，鑒于稅務機關代開增值稅專用發票僅限于已辦理稅務登記的小規模納稅人（包括個體經營者），因你司已是一般納稅人，因此不可到稅務機關申請代開增值稅專用發票，你司在此期間只可以領購開具增值稅普通發票，并按17%的稅率計算銷項稅額。4、本公司是剛剛注冊的，現想申請一般納稅人資格，請問應如何申請？答：企業申請辦理一般納稅人認定手續時，應提供書面申請報告并填報《增值稅一般納稅人資格認定申請審核表》，連同下列資料一起報送企業主管國稅機關辦稅服務廳受理窗口：（一）營業執照、稅務登記證副本；（二）法人代表、辦稅人的身份證明（包括身份證原件及復印件、護照原件及復印件）；（三）經營場地資料，如房產證或租賃合同協議；（四）分支機構申請認定時，應同時提供總機構《增值稅一般納稅人資格認定通知書》，以及總機構確認其為統一核算的分支機構的證明材料；（五）具有進出口經營權的企業、從事鹽業批發的企業還應提供有關部門出具的批準其可從事相關業務的證明材料；（六）主管國稅機關要求提供的其他資料。七、一般納稅人管理1、你好！請問汕頭市的商業企業申請暫認定為增值稅一般納稅人之后，申請增值稅專用發票的最高開票額是多少？答：按照稅務總局國稅發明電[2004]37號文規定，新辦小型商貿企業必須自稅務登記之日起，一年內實際銷售收入達到180萬元，方可申請一般納稅人資格認定，并相繼實行輔導期管理制度，其增值稅防偽稅控開票系統最高開票限額不得超過一萬元。2、請問一般納稅人ＡＢＣ類是怎么進行確定分類的？答：根據《轉發國家稅務總局關于印發〈納稅信用等級評定管理試行辦法〉的通知》（粵國稅發[2003]247號）規定，廣東省國家稅務局《關于下發重新修訂的〈廣東省增值稅一般納稅人分類管理辦法〉的通知》(粵國稅發[2003]107號)中關于增值稅一般納稅人的分類標準部分的相關規定同時廢止，對增值稅一般納稅人的分類標準按《納稅信用等級評定管理試行辦法》進行。納稅信用等級評定按照國家稅務總局《關于印發納稅信用等級評定管理試行辦法》第四條的評定內容分指標計分，設置A、B、C、D四級。考評分在95分以上的，為Ａ級，考評分在60分以上95分以下的，為Ｂ級，考評分在20分以上60分以下的，為Ｃ級，考評分在20分以下的，為Ｄ級。分數的具體評定說明見附件1《納稅信用等級量化評定表》。3、我是一個來汕的創業者，經營計算機行業，是小規模納稅人，請問稅率是多少？還有，為什么增購發票的手續和程序那么麻煩？答：按照《中華人民共和國增值稅暫行條例》有關規定，小規模納稅人銷售貨物或者應稅勞務，實行簡易辦法計算應納稅額。經營計算機屬商業小規模納稅人，按照規定，商業小規模納稅人銷售貨物或者應稅勞務的征收率為4%。你每月需使用的發票用量，是稅務機關按照有關規定，通過實地調查，核實你的經營情況（銷售額）后進行審批的；如果你的經營情況發生了變化，需使用大額位的發票或增加發票的用量，可以向主管稅務機關提出申請，主管稅務機關在核實后，會根據你的實際經營狀況，按照規定，重新核發你每月發票的使用量。4、商貿企業輔導期一般納稅人,在當月第二次購票時需預繳第一期銷售額稅款(4%),預繳稅款可抵減應納稅款,如預繳多于應納,是否可以在次月第二次購票時抵減？答：納稅人在輔導期內增購專用發票，實行預繳增值稅的辦法，預繳的增值稅可在本期增值稅應納稅額中抵減，抵減后預繳增值稅仍有余額的，應于下期增購專用發票時，按次抵減。5、你好,我公司是生產出口企業,兼有內銷業務,為一般納稅人,原來稅務局規定我公司每月用票量20份,分4次購買,每次5份,但今年起每月平均用票量超過10份,這樣使辦稅員三番二次奔波于稅務局,效率低,也造成不便,所以在10月份我公司重新申請每次購票20份,但當地稅務局譏笑這種作法,這是為什么?答：你反映的專用發票供應問題涉及到納稅人的納稅信用等級，按照規定：A級企業原則上一次可供應1個月的發票用量；B級企業一次最多只供應半個月的發票用量；C級企業一次最多只供應有盡1/3月的發票用量，且都應實行驗舊購新。在此基礎上稅務機關還根據企業的實際經營等各方面情況，實行限量限次供應。如果你單位納稅信用等級屬于A級企業的，可以申請月一次性供應發票。八、代開發票管理：1、我想問一下，個體經營想要開１７%的增值稅發票，稅局能否代開？如果可以的話，需要什么手續？謝謝答：不可以。根據《增值稅暫行條例》規定，小規模納稅人銷售貨物或者應稅勞務是實行簡易辦法征收稅款，即按征收率（6%或4%）計算征收稅款。你單位屬小規模納稅人，發生增值稅應稅行為、需要開具專用發票時，可向其主管稅務機關申請代開，代開的增值稅專用發票上的“稅率”欄填寫你單位的增值稅征收率。2、請問小規模納稅人怎么申請代開增值稅專用發票？答：增值稅小規模納稅人申請代開專用發票時，應填寫《代開增值稅專用發票繳納稅款申報單》，連同稅務登記證副本，到主管稅務機關稅款征收崗按專用發票上注明的稅額全額申報繳納稅款，同時繳納專用發票工本費。3、我們是潮陽區的從事服裝銷售批發的個體工商戶，現在有個客戶批發一批服裝，需要我們開具17%增值發票，請問我們要怎么處理？答：根據國家稅收政策的有關規定，必須是增值稅一般納稅人才可以開具增值稅專用發票。如果你的銷售額達到標準（年應稅銷售額工業100萬元，商業180萬元），可向主管稅務機關申請增值稅一般納稅人資格認定，經主管稅務機關審核批準后，可按適用稅率自行開具增值稅專用發票；如果你還沒有達到一般納稅人標準的，可到主管稅務機關申請代開增值稅專用發票，稅務機關將按征收率（工業6%，商業4%）為你代開增值稅專用發票。市局流轉稅管理科20**年10月流式細胞術在哺乳動物精液質量檢測中的應用基金項目：國家自然科學基金（基金項目：國家自然科學基金（39970117）；中國科學院重大項目（KZ952-J1-109）1,2,44通訊作者（Correspondingauthor）,TelE-mail:wji@mail.kiz,摘要：精液檢測的首要目標就是快速準確地確定其生育力。同時具備多種特性功能完整的精子才能受精，因而只有同時客觀地檢測多個指標，才能更好地反映精子的生育力。精子檢測的傳統方法費時費力，檢測精子數量少，指標單一，而且易受操作者的主觀影響，不能準確地反映精子功能。流式細胞術(FCM)為精子功能研究提供了一種快速、客觀、多指標、大通量的檢測手段；利用FCM檢測精子的質膜完整性、頂體狀態、染色質結構、線粒體功能以及細胞凋亡等，可以得知精子的相關功能情況。隨著新的熒光探針、染色方法的不斷開發和改進，FCM為精液質量檢測提供了一種新的檢測平臺，應用前景極其廣闊。關鍵詞：流式細胞術；精子；檢測；熒光探針EvaluationofMammalianSemenQualitybyFlowCytometryCAIKe-jun1,2,SIWei1,2,LIYA-hui1,2,3,JIWei-zhi1,4(1.KunmingInstituteofZoology,theChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;2.GraduateSchool,theChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China3.CollegeofFoodScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)Abstract:Theprimarygoalofallsemenanalysesistoaccuratelydeterminethefertilizingpotentialofasemensamplerapidly.Sinceaspermatozoonmustpossessmanyattributesinordertofertilizeanoocyte,theonlywaythatwecanmorepreciselypredictthefertilityistodevelopunbiasedassaysthatmeasureseveralspermtraitssimultaneously.Conventionallaboratoryassaysofspermatozoa,usingsubjectivemethod,manyaretimeconsuming,andarenecessarilyconductedonsamplesofrelativelysmallsize,fallshortofpredictingthespermfunction.Flowcytometry(FCM)permitsustoobjectivelymeasurethousandsofspermformultiplecharacteristicsinashorttimewithminimumpreparation.TheapplicationsofFCMtoevaluationofsemenqualityincludingspermmembraneintegrity,acrosomestatus,chromatinstructure,mitochondrialfunctionaswellasapoptosisetc,provideusvaluableinformationregardingspermfunction.Newfluorescentprobesandtechniquesarecontinuouslybeingdeveloped.FCMofferspowerfultoolsandexcitingopportunitiesforimprovingourabilitytoaccuratelyevaluatesemenquality.Keywords:Flowcytometry;Spermatozoa;Evaluation;Fluorescentprobes精液質量檢測在臨床治療不孕癥及家畜良種繁殖和育種中具有重要作用。常規的精液檢查（精子密度、活力、形態等）重復性差，提供的精子功能的信息非常有限，不能為生育力提供準確評估的依據。其他方法（包括精子染色的顯微鏡檢測、精子-頸粘液相互作用檢查、精子穿透去透明帶倉鼠卵實驗、低滲腫脹實驗以及超微結構檢查等）雖然可以提供精子功能方面的一些信息，但費時費力；檢測精子數量少；指標單一；且易受操作者的主觀影響，不能準確反映精子的功能。近年來，隨著生殖生物學的發展和人類對輔助生殖技術的迫切需求，基于精子形態學觀察為主的傳統檢測方法已不能滿足人們的需要，因而尋找一種快速、準確的精液質量檢測方法顯得十分迫切。流式細胞術(flowcytometry,FCM)是20世紀70年代發展起來的一種單細胞快速分析技術，已廣泛應用于細胞生物學和醫學的各個領域。流式細胞術的基本原理是：特異熒光探針標記的單細胞懸液在管道中穩定地流動，細胞一個個依次經過噴嘴，經恒定功率的激光束激發后產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向的光電二極管和側向的光電倍增管接收，經計算機處理，細胞的一系列特性就被快速準確地測定。在此基礎上還可以根據有關參數把所需細胞亞群從整個樣品中分選出來。FCM在哺乳動物精子研究中發揮著重要作用：通過分析生精細胞增殖周期研究精子的發生過程；還可根據X、Y精子DNA含量的差異進行精子性別鑒定，即精子分選；檢測精液質量。流式細胞儀為精子功能實驗提供了快速、客觀、多指標、大通量的檢測手段，彌補了傳統方法的缺陷，成為一種檢測精液質量的新平臺。隨著新的熒光探針和染色方法的不斷開發和改進，這一新的檢測技術在近20年來應用越來越廣泛，也必將在人類輔助生殖技術、畜牧業凍精商業化運作以及珍稀瀕危物種的精子凍存研究中展現更加廣闊的應用前景。本文就流式細胞儀近年來在檢測精子的質膜完整性、頂體狀態、染色質結構完整性、線粒體功能、細胞凋亡等方面的應用作一簡要綜述，并對其應用前景作一展望。1測定精子的質膜完整性精子的質膜完整性又可稱為精子的活力（viability），是檢測精液質量的重要指標之一，也是FCM應用最多的領域。對死精子特異的熒光染料有碘化丙錠(propidiumiodide，PI)、Hoechst33258、溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)、溴乙啡錠二聚體（ethidiumhomodimer-1,EthD-1）和Yo-Pro-1等，其中PI最為常用。它們是膜不透性的DNA探針，只有質膜破損的精子，染料才能進入細胞與DNA結合。對活精子特異的熒光染料有SYBR-14、羧基熒光素雙醋酸鹽(carboxyfluoresceindiacetate,CFDA)、羧基二甲基熒光素雙醋酸鹽（carboxydimethylfluoresceindiacetate,CMFDA）、Carboxy-SNARF-1和SYTO-17等。它們是膜通透性的染料，能進入細胞膜完整的精子。其中，Carboxy-SNARF-1是一種胞內pH指示劑，在活精子內發橙紅色熒光(Penaetal，1999)；SYTO-17標記活精子的細胞核，發紅色熒光(Thomasetal,1997)；CFDA和CMFDA是一種非熒光化合物，在活細胞胞內被非特異酯酶水解，形成一種很強的熒光染料，發綠色熒光(Penaetal,1998;Ericssonetal,1989)。這兩類染料經常聯合使用。對死精子特異的熒光染料雖然可以單獨使用，但效果不如聯用好。SYBR-14和PI聯合使用，可以很好地檢測精子活力（Garneretal，1994；Garner&Johnson，1995）。其原理可能是PI進入死精子頭部后端，取代了SYBR-14或使SYBR-14的熒光猝滅。樣品經流式細胞儀檢測可得3種亞群：①被SYBR-14染成綠色的活精子，并且比死精子亮得多；②被PI染成紅色的死精子；③同時染上并發出兩種熒光的雙陽性精子，正處于從活向死的過渡狀態。這種方法已用于檢測許多物種的精子活力。CFDA、CMFDA、SYTO-17等分別與PI聯合染色，通過流式細胞儀檢測也可得到類似的3類精子。Carboxy-SNARF-1也可以和PI聯合使用，Carboxy-SNARF-1發橙紅色熒光,但其熒光值大大低于PI的熒光值，用同一個探測器也能把兩者區別開(Penaetal,1999)。這一組合的優點是可以和發綠色熒光的頂體探針結合。否則只用PI測活力，活精子和顆粒較大的雜質（如蛋黃顆粒）都不能被PI標記，也就不能把兩者區分開。Hoechst33342是一種膜通透性活體染料，死精子和活精子都標記，而PI只標記死精子。本研究室發展了一種僅用紫外激光就同時激發這兩種探針來檢測精子活力的方法：活精子只被Hoechst33342標記，發藍色熒光；死精子為PI陽性，同時也被Hoechst33342標記，故死精子為粉紅色。這一染色方法適用于流式和熒光顯微鏡檢測，且可以和發綠色或黃色熒光的其他探針合用，同時檢測多個指標。該方法已成功地用于牛、獼猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的檢測（資料待發表）。一般認為，在精子活力檢測的所有方法中，SYBR-14與PI的聯合使用效果最佳。該組合染色時間短，對溫度要求不嚴格，且都是核染料。而其他組合染色時間長，標記的細胞器不同，易出現誤差。2檢測頂體狀態在受精過程中，哺乳動物剛射出的精子在體內要經過獲能和頂體反應，才能穿入卵細胞并與其融合，完成受精。因此檢測精子的頂體狀態，有助于反映精子的受精能力。金霉素(chlortetracycline,CTC)頂體染色法,是熒光顯微鏡檢測的常用方法，可客觀而定量地評價精子獲能、頂體反應(DasGuptaetal,1993)。但這種染料在FCM檢測時不能很好地將獲能與未獲能的精子分開，而且樣品要固定，所以CTC染色法不適用于FCM（Rathietal,2001）。精子在獲能和頂體反應過程中，精子膜外源凝集素受體會發生變化。因此可以利用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的凝集素檢測精子的頂體狀態。已經有多種凝集素被用于精子頂體狀態檢測，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。其中PNA和PSA較常用，PNA效果最好。經電子顯微鏡觀察證實，PNA特異結合頂體外膜（Szaszetal,2000）。FITC-PNA檢測頂體反應有兩種樣品處理方法：①樣品需要固定，FITC-PNA才能穿過質膜和頂體外膜，標記頂體。頂體完整的精子可結合更多的FITC-PNA，故FITC-PNA熒光值變得更高；而頂體反應后，頂體丟失，FITC-PNA的熒光值又較低(Purvisetal,1990)。死亡降解的精子也會出現頂體丟失，但只有活精子的頂體丟失才能稱為真正的頂體反應。因而檢測頂體反應必須同時檢測精子的活力。Taoetal（1993a）先用Hoechst33258標記，之后加入一定量鮭魚精子DNA（SS-DNA）結合多余的染料，洗滌后再固定，再用FITC-PNA標記，Hoechst33258陰性、PNA陽性者為頂體反應的精子。盡管這種方法可以同時測得精子活力和頂體狀態，但該方法較煩瑣。②不經固定，直接用精子活力染料PI（或Hoechst33258、EthD-1）和FITC-PNA標記。其結果PI+為死精子；PI－/PNA+為頂體反應精子；PI－/PNA－為頂體完整的活精子(Grahametal,1990；Szaszetal,2000)。凝集素對精子有一定毒性，染色時間不宜過長。此外，熒光素標記的頂體特異性單克隆抗體結合Hoechst33258的雙標記也能檢測頂體反應(Taoetal,1993b)。完整頂體的活精子呈酸性，可被嗜酸性探針LysoTracker特異標記，呈綠色熒光。經證明，LysoTracker陽性率與顯微鏡觀察到的正常頂體的百分率相吻合（Thomasetal,1997）。Ca2+內流是精子獲能的一種表現形式，因此可用鈣離子探針（如fluo-3和indo-1等）檢測Ca2+的濃度變化（Harrisonetal,1993）。質膜不穩定性加劇也是精子獲能的另一種表現形式，因而也可用疏水性染料與膜不透性探針反映精子獲能。精子獲能后細胞膜流動性增大，染色強，染料分布在質膜的外層。常用部花青540（merocyanine54，發射光峰值為570～590nm）與Yo-Pro-1（發射光峰值509nm）雙標記，可檢測到死精子、未獲能活精子和獲能活精子(Harrisonetal,1996)。3檢測精子染色質結構完整性精子染色質結構完整性對于精確傳遞遺傳物質至關重要。精子核高度致密，其DNA與魚精蛋白緊密結合，這樣可以將父方遺傳信息準確無誤地導入卵，繼而傳給后代。檢測精子染色質結構完整性有PI染色和吖啶橙（acridineorange,AO）染色兩種方法。Pasteuretal(1991；1994)在研究人鮮精和凍精的PI染色特性時發現，DNA直方圖上有一主峰，該主峰右側還延伸出一小峰，小峰代表的是核凝聚度降低的精子，其染色質結構不穩定，可染性增強；凍精的主峰及小峰熒光值顯著高于鮮精，說明冷凍使精子染色質凝聚度降低，DNA可染性增強。異常精子DNA直方圖主峰加寬，右移，出現小的附加峰,DNA熒光值與精子正常形態百分率呈顯著負相關（Huang&Pan，1998）。用PI染色來檢測精子染色質結構完整性報道的還較少，實驗方法還不統一，提供的信息也很較少，故應用并不廣泛。廣為使用的權威方法是精子染色質結構檢測（spermchromatinstructureassay，SCSA）。通過熱處理，來自低生育力的牛、小鼠和人精子的染色質更容易變性（Evensonetal，1980）；采用酸變性處理對人和動物精液的研究得到相同的結論(Evensonetal,1999，2000；Bocheneketal，2001)。因而利用染色質異常的精子易受熱或酸變性成單鏈DNA，與染料吖啶橙結合發紅色熒光；而染色質正常的精子能保持完整DNA雙鏈結構，與吖啶橙結合發綠色熒光這一特性，樣品經熱或酸變性處理后，若紅光值比例增高，則說明染色質結構異常增加。通過專用軟件進行數據處理，SCSA可檢測下列參數：αt（指紅色熒光與總熒光的比值，即αt=紅/紅+綠）；COMPαt(cellsoutsidethemainpopulation，指主群以外的精子占總數的比例)；SDαt(thestandarddiviationofalphat，指αt的標準差)；HIGRN(highgreenstainability，指綠色熒光可染性增加的精子所占百分數)。SCSA主要用于以下方面。3.1評估精子生育力Evensonetal（1999）提出COMPαt是預測妊娠成敗的最佳指標，COMPαt30％可作為評估精子的生育力高低的域值，大于該值的實驗組無妊娠成功者。Larsonetal（2000）對SCSA在體外受精（IVF）和胞質內單精注射（ICSI）妊娠結果的預測效果進行了研究，發現7例妊娠成功者與14例妊娠失敗者相比，其精子的COMPαt值差異顯著[（15.44.6）％與（31.13.2）％，P＝0.01]；認為如果精子的COMPαt27％，妊娠不能成功。3.2評價各種體外處理技術對精子染色質結構完整性的影響精液的體外處理是否會影響精子DNA完整性是需要慎重考慮的問題。Zinietal（1999；2000）發現，Percoll密度梯度離心處理后，不育組精液DNA變性率（COMPαt）明顯升高，正常組無顯著變化；而上游法可明顯改善回收精子的DNA完整性。梯度離心法雖然在精子活動率以及正常形態方面優于玻璃纖維過濾法，后者卻能提高精子DNA完整性（SDαt）和活力（Larsonetal,1999）。這要求重新檢查目前常用的精液體外處理技術，避免造成對精子染色質結構完整性的破壞。3.3評估癌癥治療以及各種外源因素對精子發生的影響Kobayashietal（2001）發現絕大多數癌癥患者精子的DNA損傷普遍存在，αt、COMPαt值顯著高于正常對照組。術前染色質結構正常的睪丸癌患者，比異常者更易恢復精子發生（Fossaetal,1997）。小鼠睪丸若暴露于高于正常生理溫度的環境中，會損傷精子染色質結構完整性，這一指標比精子頭部形態檢測更靈敏（Saileretal,1997）。Bondeetal(2002)對帶鉛環境下作業的工人檢測發現，血液中鉛濃度高者，精子DNA更易變性。SCSA也能很好的監測各種化療藥物對精子發生的影響（Spanoetal,1996）。4檢測精子的線粒體功能線粒體的主要功能是產生能量，為精子運動提供ATP。常用的檢測線粒體功能的熒光探針有：Rhodamine123（R123）、MITO和JC-1。R123是一種能滲透入細胞，帶陽離子的熒光探針，發綠色熒光。R123可檢測精子線粒體有無功能，但不能區別線粒體膜電位的高低。MITO是一種新型線粒體探針，在水溶液中并不發熒光，而當積聚在線粒體內，不論其膜電位如何皆發綠色熒光。JC-1在檢測精子線粒體膜電位方面具有重要作用：在精子線粒體膜電位低時，以單體形式存在，發綠色熒光；當膜電位高時，形成J-聚體，發橙色熒光。Garneretal（1997）對3種染料作了比較研究，發現三者都與鏡檢活動精子百分率高度相關。其中，JC-1的陽性率最高，MITO的最低；R123和MITO只有一群陽性，而JC-1可反映出線粒體膜電位高低的兩群；JC-1染色的特異性最好，僅在線粒體部位發黃色或綠色熒光，R123在精子頭部和尾部有非特異性染色，MITO只在精子頭部有非特異性染色。目前認為JC-1是檢測精子線粒體功能最適合的探針。用JC-1對大鼠精子檢測中發現在精子中段線粒體部位發黃色或綠色熒光，反映其膜電位的高低，說明JC-1對精子線粒體染色的特異性很好；流式檢測JC-1的染色模式與分組精子的預期結果高度相關（Gravanceetal，2001)。在牛、馬的精子檢測中也得到相似的結果(Garneretal,2001；Gravanceetal，2000)。線粒體特異的熒光探針經常和檢測精子活力的探針同時使用。Evensonetal(1982)用Rhodamine123和EB染色，同時檢測人精子活力和線粒體功能。發現精子攝取R123到達平衡的速度較快，只需10min；R123陽性率與精子活動性相關，反映線粒體的功能變化。Augeretal（1993）用R123與PI雙重染色，流式檢測結果為：死精子為PI陽性、R123陰性；有線粒體功能的活精子為PI陰性、R123陽性；已無線粒體功能的活精子為PI、R123雙陰性；PI、R123雙陽性的精子不記數。Thomasetal(1998)用JC-1和PI聯合使用對牛精子線粒體功能進行檢測，能分辨出精子死活和線粒體功能的高低，并證明JC-1是檢測精子經過冷凍過程后受損程度的最可靠指標。但該方法有一缺陷，JC-1的J-聚體發出的橙色熒光，會與PI的紅色熒光部分重疊(Garner&Thomas,1999)。因此，還需要探索新的染色方法，更準確地檢測精子的線粒體功能。5檢測精子凋亡盡管精子作為一種終端的不能分裂的細胞，是否存在凋亡目前尚無定論。但研究人員已經采用檢測體細胞凋亡的方法來檢測精子的質量。而FCM被認為是當今檢測凋亡最敏感、最可靠的手段。常用的方法是AnnexinV/PI雙染法和末端標記法（TUNEL）。AnnexinV/PI雙染法的原理是：在凋亡的早期階段，磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內層轉移到細胞膜外層；AnnexinV為一種依賴于Ca2+的磷脂蛋白（一般用FITC標記），對PS有高度的親和力，可用來探測PS是否暴露在細胞膜外表面；結合PI染色，可區分壞死和凋亡。凋亡細胞為AnnexinV陽性、PI陰性。TUNEL法的原理是：凋亡細胞DNA斷裂后，其缺口3?端可在末端脫氧核苷酸轉移酶作用下結合FITC標記的dUTP，或者結合BrdU，BrdU再與FITC標記的抗體孵育。凋亡細胞為FITC陽性。兩種方法相比，AnnexinV/PI聯染法樣品不需固定，更方便易行。Glanderetal(1999)的結果表明，AnnexinV/PI聯染法可很好的用于精子質量檢測。精子冷凍后其AnnexinV陽性率明顯升高，并同精子的不同運動參數高度相關。Oosterhuisetal(2000)用AnnexinV/PI聯染法和TUNEL法檢測了人新鮮精液的凋亡情況，發現兩種方法檢測到的凋亡率均為20%左右，無顯著性差異；AnnexinV陰性率與精子濃度和活動率，以及dUTP陽性率與精子濃度，都呈高度負相關。Anzaretal(2002)用上述兩種方法檢測了牛新鮮精液和凍精的凋亡情況，并與繁殖率作了比較，兩種方法都檢測到冷凍使精子凋亡率升高，TUNEL法檢測到的鮮精凋亡率高于AnnexinV/PI雙染法。新鮮精液中凋亡精子的出現可能是其低生殖力的原因之一。AnnexinV/PI雙染法