PCR基因擴增儀

(PCRGeneAmplifier)

1ppt課件.PCR基因擴增儀

內容提要1.PCR基因擴增儀的工作原理PCR技術的原理及發展PCR基因擴增儀的工作原理2.PCR擴增儀的分類與結構定性PCR擴增儀實時熒光定量PCR擴增儀3.PCR擴增儀的性能指標、操作規程

PCR擴增儀的性能指標PCR擴增儀的操作規程4.PCR擴增儀的應用2ppt課件.內容提要1.PCR基因擴增儀的工作原理2ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理一、PCR技術的發展Khorana(1971)等最早提出核酸體外擴增的設想：“經DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因。”1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期間，發明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉下別墅的路上,猛然閃現出“多聚酶鏈式反應”的想法。1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4,683,202），Mullis是第一發明人；1985年12月20日在Science雜志上發表了第一篇PCR的學術論文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。3ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理一、PCR技術的發展聚第一節PCR基因擴增儀的工作原理二、PCR技術的原理體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個循環，呈指數級擴大待測樣本中的核酸拷貝數。簡單的說，PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術，可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。4ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理二、PCR技術的原理4p第一節PCR基因擴增儀的工作原理模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；DNA模板與引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍5ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理模板DNA的變性：模板D第一節PCR基因擴增儀的工作原理PCR基因擴增儀的工作關鍵DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。從PCR反應基本原理可以看出，PCR基因擴增儀工作關鍵是溫度控制。6ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理PCR基因擴增儀的工作關第一節PCR基因擴增儀的工作原理7ppt課件.第一節PCR基因擴增儀的工作原理7ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構8ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構8ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構熒光實時定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技術在PCR反應體系中加入特異性的熒光染料或探針熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加通過檢測熒光信號，從而實時監測整個PCR反應過程最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析9ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構熒光實時定量PCR（rea第二節PCR擴增儀的分類與結構實時熒光定量PCR儀

金屬板式實時定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀

各孔獨立控溫的定量PCR儀10ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構實時熒光定量PCR儀金屬第二節PCR擴增儀的分類與結構金屬板式實時定量PCR儀

可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應，標準曲線的反應條件難以做到與樣品完全一致11ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構金屬板式實時定量PCR儀第二節PCR擴增儀的分類與結構ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀12ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構ABI7500熒光定量P第二節PCR擴增儀的分類與結構離心式實時定量PCR儀溫度均一性較好使用的是同一個激發光源和檢測器，隨時檢測旋轉到跟前的樣品，有效減少系統誤差可容納樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能13ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構離心式實時定量PCR儀1第二節PCR擴增儀的分類與結構Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

14ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構Rotor-Gene30第二節PCR擴增儀的分類與結構各孔獨立控溫的定量PCR儀不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，適合多指標快速檢測。SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運用，還可實現任意梯度反應。SmartCyclerⅡ上樣不如傳統方法方便，而且需要獨特的扁平反應管，使用成本較高。15ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構各孔獨立控溫的定量PCR儀第二節PCR擴增儀的分類與結構SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀16ppt課件.第二節PCR擴增儀的分類與結構SmartCyclerⅡ熒第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程及常見故障的排除

一、PCR擴增儀的性能指標17ppt課件.第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程及常見故障的排除（二）熒光檢測系統

激發光源

檢測器

發光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管18ppt課件.（二）熒光檢測系統激發光源檢測器發光二極管鹵鎢燈光源第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程（三）軟件簡便的人性化設計最能滿足其需求。新型的PCR儀很注重程序編寫的簡易性，易學易用具有實時信息顯示、記憶存儲多個程序、自動倒記時、自動斷電保護等功能，很多還可以免費升級。19ppt課件.第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程（三）軟件19（四）其他多樣化樣品基座設計、熱蓋等都使PCR儀越來越人性化。第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程20ppt課件.（四）其他第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程20第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程二、PCR擴增儀的操作規程普通PCR擴增儀的操作非常簡便，接通電源，儀器自檢，設置溫度程序或調出儲存的程序運行即可。定量PCR擴增儀的操作和普通PCR儀基本相同。21ppt課件.第三節PCR擴增儀的性能指標、

操作規程二、PCR擴增第四節PCR擴增儀的應用三、PCR擴增儀的應用1.感染性疾病的分子診斷和研究2.遺傳性疾病的分子診斷和