高級動物生物化學第一二三章第一篇蛋白質分子基礎及其實驗技術第二篇基因表達調控第一篇蛋白質分子基礎及其實驗技術第一章蛋白質的化學組成及其分類（1）第二章蛋白質分子結構（3）第三章蛋白質一級結構測定（4）第四章蛋白質的化學修飾（4）第五章蛋白質結構與功能的關系（2）第六章蛋白質-蛋白質相互作用(2)第七章蛋白質的制備的方法與技術（4）第二篇基因表達調控第一章原核生物基因表達的調控（10）

§1引言§2細菌對營養的適應§3組成蛋白與調解蛋白§4操縱子學說§5操縱子基因結構§6乳糖操縱子§7阿拉伯糖操縱子§8氨基酸合成的操縱子

第二章真核生物基因表達調控（12）第一章蛋白質的化學組成及其分類蛋白質是生物體現生命特征的物質基礎。在生物體含有成千上萬種蛋白質，各具備其特異的生物學功能：如催化功能、結構功能、收縮功能、運輸和貯存功能、調節功能、免疫功能、信號傳導功能等等。具有特定生物學功能的蛋白質應具有特定的結構。結構決定功能；結構改變導致功能改變。1955年，Sanger，胰島素一級結構。上世紀80年代后，隨著分子生物學技術的進步，特別是人類基因組計劃的完成，人們在基因水平破譯了數以千計的蛋白一級結構。蛋白質的空間結構（立體結構）主要通過現代生物物理方法，如X-光衍射、核磁共振、圓二色性光譜、紫外差光譜、激光拉曼光譜等方法進行研究。研究蛋白質的空間結構對了解蛋白與蛋白、蛋白與其他物質相互作用的過程，藥物的設計等具有重要意義。一、蛋白質的元素組成組成蛋白質的元素：C（50%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S（0-3%）、其它元素微量（P、I、Mo、Cr、Zn、Cu等）；蛋白質的平均含氮量為16%，此為凱氏定氮法測定蛋白質含量的基礎。二、蛋白質的基本結構單位—氨基酸組成蛋白質的氨基酸為：L--氨基酸（L-α-aminoacids)L--氨基酸（L-α-Aminoacids)CRCOOHHH3N+CCH2OHCHOHHOL--甘油醛（L-Glyceraldehyde)

蛋白質中常見氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine

脂肪族氨基酸氨基乙酸氨基酸的結構

脂肪族氨基酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine-氨基丙酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine

脂肪族氨基酸-氨基異戊酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine

脂肪族氨基酸-氨基異己酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸Ileucine

脂肪族氨基酸-氨基--甲基戊酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline

亞氨基酸-吡咯烷基--羧酸，吡咯啶--甲酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸（蛋氨酸）Methionine

含硫氨基酸-氨基--甲硫基丁酸氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸

Methionine半胱氨酸

Cysteine含硫氨基酸-氨基--巰基丙酸氨基酸的結構

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine-氨基--苯基丙酸氨基酸的結構

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine-氨基--對羥苯基丙酸氨基酸的結構

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸TryptophanTrp-氨基--吲哚基丙酸氨基酸的結構

堿性氨基酸精氨酸

Arginine-氨基--胍基戊酸氨基酸的結構

堿性氨基酸精氨酸

Arginine賴氨酸

Lysine，-二氨基己酸氨基酸的結構

堿性氨基酸精氨酸

Arginine賴氨酸

Lysine組氨酸

Histidine-氨基--咪唑基丙酸氨基酸的結構

天冬氨酸Aspartate

酸性氨基酸-氨基丁二酸氨基酸的結構

天冬氨酸Aspartate谷氨酸

Glutamate

酸性氨基酸-氨基戊二酸氨基酸的結構

絲氨酸

Serine

含羥基氨基酸-氨基--羥基丙酸氨基酸的結構

絲氨酸

Serine蘇氨酸

Threonine

含羥基氨基酸-氨基--羥基丁酸氨基酸的結構

天冬酰胺Asparagine

含酰胺氨基酸-酰胺基-

-氨基丙酸氨基酸的結構

天冬酰胺Asparagine谷酰胺

Glutamine

含酰胺氨基酸-酰胺基--氨基丁酸根據氨基酸R基團的不同，將氨基酸分為五類：Nonpolaraliphaticaminoacids:

甘GlycineGlyG丙AlanineAlaA脯ProlineProP纈ValineValV亮LeucineLeuL異亮IsoleucineIleI蛋MethionineMetM2.Aromaticaminoacids:

苯丙PhenylalaninePheF酪

TyrosineTyrY

色TryptophanTrpW

3.Polar,unchargedaminoacids:

絲SerineSerS蘇ThreonineThrT半胱CystineCysC天酰AsparagineAsnN谷酰GlutamineGluQ4.Positivelychargedaminoacids賴LysineLysK組HistidineHisH精ArginineArgR5.Negativelychargedaminoacids天冬Aspartate

Asp

D

谷Glutamate

Glu

E

蛋白質氨基酸（20種）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸堿性氨基酸賴氨酸組氨酸精氨酸中性氨基酸極性氨基酸非極性氨基酸絲氨酸蘇氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰氨谷氨酰胺甘氨酸丙氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸色氨酸脯氨酸頡氨酸分類Ⅰ單純蛋白質（如清蛋白、球蛋白、組蛋白、谷蛋白、等）結合蛋白質（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金屬蛋白等）分類Ⅱ：按生物學功能可將蛋白質分為酶、調節蛋白、結構蛋白、轉運蛋白等等；分類Ⅲ分類Ⅳ纖維狀蛋白質（一般不溶于水。典型的有：膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白、肌球蛋白等）球狀蛋白質（可溶性好。典型的有：胞質酶類等）膜蛋白（與細胞的膜系統結合而存在）單體蛋白質（寡）多聚蛋白質蛋白質的分類第二章蛋白質的分子結構一、蛋白質的一級結構：蛋白質的一級結構指多肽鏈氨基酸的排列順序。在蛋白質分子中，氨基酸是以肽鍵形式連接起來的。肽鍵是由一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基脫水形成的酰胺鍵。

肽鍵二肽

Rgroup氨基端（N端）羧基端（C端）氨基酸殘基（residue）肽鍵蛋白質分子在結構上可分為：一、二、三、四級結構。一級結構又稱為化學結構；二--四極結構稱為空間結構或構象。構型與構象的概念：構型(Configuration)：分子中各原子特有的空間排列。這種排列的改變涉及到共價鍵的生成與破壞，與氫鍵無關。如順反異構（順-，反-）、旋光異構（D-，L-）。構象(Conformation)：分子中由于單鍵的旋轉而產生的原子空間排列。這種排列的改變僅涉及氫鍵等次級鍵得生成遇破壞，不涉及共價鍵的生成與破壞。蛋白質分子中原子或基團的空間排列叫蛋白質的分子構象。蛋白質構象的形成是由于單鍵的旋轉而引起的。蛋白質多肽鏈主鏈上的共價鍵都是單鍵結構，如果所有的單鍵都可以自由旋轉，多肽鏈將有無數個構象。但實際上某一特定的多肽鏈在一定條件下常形成一種或少十幾種構象。可見蛋白質主鏈上的單鍵并不都能自由旋轉。經過X-光衍射證明：在普通有機化合物分子中，C-N單鍵的鍵長：14.9nm；C=N雙鍵的鍵長：12.7nm；肽鍵的C-N單鍵的鍵長：13.2nm由此可見，肽鍵中的C-N鍵長介乎于普通C-N和C=N之間。它雖然是單鍵，卻具有部分雙鍵的性質，不能自由旋轉。這樣與C-N相連的4個原子：兩個C、一個H和一個O與C-N位于一個平面上，這個平面被稱為酰胺平面或肽鍵平面。由于此平面可塑性差，又稱為剛性平面。二、蛋白質的分子構象：肽鍵平面是蛋白質構象的基本結構單位，在肽鏈中，相鄰的肽鍵平面可以圍繞碳原子自由旋轉形成多種狀態的立體結構。多肽鏈有規律的盤繞、折疊而形成的空間結構叫蛋白質二級結構。包括-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲。維持二級結構的化學鍵為氫鍵。三、蛋白質的二級結構（Secondarystructure）（一）-螺旋(-helix)肽鏈中相鄰的肽鍵平面通過-碳原子進行旋轉，盤繞而成的右手雙螺旋結構叫-螺旋。Inprotein,theαhelixisamajorstructuralmotifinSecondarystructure.ItwasfirstpostulatedbyLinusPauling,(Chemist1901-1994，USA,Two-timewinneroftheNobelPrize）RobertCorey,andHermanBransonin1951basedontheknowncrystalstructuresofaminoacidsandpeptidesandPauling'spredictionofplanarpeptidebonds.-螺旋(-helix)

在α-helix中，每一圈含有3.6氨基酸（即每個氨基酸旋轉100o），肽鍵平面與螺旋軸平行，氨基酸側鏈（R基團）分布在螺旋外側；相鄰螺旋之間靠鏈內氫鍵連接（即一個氨基酸殘基（n）的N-H的H與前第四個（n+4）殘基的C=O之間形成的氫鍵（N-H…O=C）。Theaminoacidsinanαhelixarearrangedinahelicalstructure,about50nm(5?)wide.Eachaminoacidresultsina100°turninthehelix,andcorrespondstoatranslationof15nmalongthehelicalaxis.Thehelixistightlypacked;thereisalmostnofreespacewithinthehelix.Allaminoacidside-chainsarearrangedattheoutsideofthehelix.TheN-Hgroupofaminoacid(n)canestablishahydrogenbondwiththeC=Ogroupofaminoacid(n+4).某些R基團對-螺旋的形成和穩定性有很大影響：A.酸性氨基酸（特別是Glu）或堿性氨基酸（Lys、Arg）集中的區域，(pH=7)由于同性電荷相斥，不利于-螺旋的形成；B.較大氨基酸（Phe,Ile,Try）集中的區域,由于空間位阻會影響其穩定性；

C.脯氨酸和甘氨酸

是-螺旋破壞者（Disruptor）,在-螺旋中很少發現有這兩個氨基酸的存在。Someaminoacids(calledhelixbreakers)likeprolineandglycinewilldisruptthehelicalstructure.Ordinarily,ahelixhasabuildupofpositivechargeattheN-terminalendandnegativechargeattheC-terminalendwhichisadestabilizinginfluence.Asaresult,αhelicesareoftencappedattheN-terminalendbyanegativelychargedaminoacid(likeglutamicacid)inordertostabilisethehelixdipole.Lesscommon(andlesseffective)isC-terminalcappingwithapositivelychargedaminoacidlikelysine.αheliceshaveparticularsignificanceinDNAbindingmotifs,includinghelix-turn-helixmotifs,leucinezippermotifsandzincfingermotifs.Thisisbecauseofthestructuralcoincidenceoftheαhelixdiameterof120nmbeingthesameasthewidthofthemajorgrooveinB-formDNA.多肽鏈中的兩個或多個區域充分伸展、平行排列而形成的片層結構叫β-折疊。平行排列分為順式和反式。反式穩定。片層之間靠氫鍵維系（即一條鏈的N-H的H與相鄰條鏈的C=O之間形成的氫鍵（N-H…O=C）；側鏈位于片層的上下。如絲心蛋白含較多的這種結構。(二)β-折疊（β-sheet）Theβsheet(alsoβ-pleatedsheet)isacommonlyoccurringformofregularsecondarystructureinproteins,firstproposedbyLinusPaulingandRobertCoreyin1951.Itconsistsoftwoormoreaminoacidsequenceswithinthesameproteinthatarearrangedadjacentlyandinparallel,butwithalternatingorientationsuchthathydrogenbondscanformbetweenthetwostrands.Theaminoacidchainisalmostfullyextendedthroughoutaβstrand.TheN-HgroupsinthebackboneofonestrandestablishhydrogenbondswiththeC=Ogroupsinthebackboneoftheadjacent,parallelstrand(s).Thecumulativeeffectofmultiplesuchhydrogenbondsarrangedinthiswaycontributestothesheet'sstabilityandstructuralrigidityandintegrity.Theα-Catomsofadjacentstrandsstand350picometres(0.35nm)apart.

順式β-折疊反式β-折疊(三)β-轉角（β-Turns)肽鏈的主鏈某一區域發生的180度轉彎的結構。附：（一）超二級結構:是指二級結構單元相互聚集形成更高級的有規律結構：1.復繞α-螺旋（coiled-coilα-helix):2.βxβ-單元（

βxβ-unit):兩條3.β-迂回（β-meande):三條或三條以上4.β-折疊筒（β-sheetbarrel):多條卷成圓筒狀5.α-螺旋-β轉角-α-螺旋：（二）結構域（structuraldomains):一條多肽鏈在超二級結構的基礎上，形成相對獨立的幾個球狀區域，并以松散的肽鏈，這種區域叫結構域。結構域往往與功能域相對應。(四)無規則卷曲指在蛋白質分子中所有原子的空間排列。即在蛋白質二級結構的基礎上，由于氨基酸殘基側鏈的相互作用，肽鏈進一步卷曲、折疊形成的立體結構或三維結構叫蛋白質三級結構。具有生物活性的蛋白質必須具有三級結構。側鏈的相互作用可以形成各種次級鍵，以維持蛋白質三級結構的空間構象。次級鍵包括：疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華引力、二硫鍵。其中疏水鍵、二硫鍵是主鍵。四、蛋白質的三級結構（tertiarystructure）胰島素三級結構有些蛋白質是由兩條或兩條以上的具有獨立三級結構的多肽鏈通過次級鍵聚合而成的，具有獨立三級結構的多肽鏈稱為亞基（亞單位）。蛋白質的四級結構就是組成蛋白質的各個亞基的空間排列。亞基可以相同，也可以不同。如血紅蛋白，2β2亞基。主要的鍵為鹽鍵。實際上好多蛋白質在發揮生理作用時常以二聚體或多聚體的形式存在。如膜上的受體。五、蛋白質的四級結構（Quaternarystructure）Inbiochemistry,manyproteinsareactuallyassembliesofmorethanoneprotein(polypeptide)molecule,whichinthecontextofthelargerassemblageareknownasproteinsubunits.Inadditiontothetertiarystructureofthesubunits,multiple-subunitproteinspossessaquaternarystructure,whichisthearrangementintowhichthesubunitsassemble.Enzymescomposedofsubunitswithdiversefunctionsaresometimescalledholoenzymes,inwhichsomepartsmaybeknownasregulatorysubunitsandthecoreisoftencalledthecatalyticsubunit.Examplesofproteinswithquaternarystructureincludehemoglobin,DNApolymerase,andionchannels.Otherassembliesreferredtoinsteadasmultiproteincomplexesalsopossessquaternarystructure.Examplesincludenucleosomesandmicrotubules.Changesinquaternarystructurearecalledconformationalchanges.Itisthroughsuchchanges,whichunderliecooperativityandallosteryin"multimeric"enzymes,thatmanyproteinsundergoregulationandperformtheirphysiologicalfunction.Theabovedefinitionfollowsaclassicalapproachtobiochemistry,establishedattimeswhenthedistinctionbetweenaproteinandafunctional,proteinaceousunitwasdifficulttoelucidate.Morerecently,peoplerefertoprotein-proteininteractionwhendiscussingquaternarystructureofproteinsandconsiderallassembliesofproteinsasproteincomplexes.血紅蛋白四級結構肌紅蛋白三級結構第三章蛋白質一級結構測定1955年,F.Sanger等分析了牛胰島素一級結構§1、蛋白測序的基本策略、步驟及注意事項一、測序策略用兩套方法將肽鏈專一性切開，各自獲得一系列片段，分離純化片段，對片段測序，最后將兩條片段組合，得到全序列。二、測序的一般步驟斷開多肽鏈內的二硫鍵測定每一肽鏈的氨基酸組成鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端確定二硫鍵的位置裂解多肽鏈為較小的肽測定各肽段的氨基酸序列利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結構拆分多肽鏈測定多肽鏈的數目三、測序注意事項1.樣品純度：要求95%以上。純度檢查方法：電泳、離子交換層析、N-端氨基酸分析、Westernblot等；2.蛋白分子量測定：方法：SDS，沉降系數；3.蛋白亞基數目：方法：SDS，用還原性上樣buffer；4.蛋白質氨基酸組成：氨基酸自動分析儀或水解蛋白后做氨基酸雙向層析；5.糖蛋白的確定：6.蛋白質末端氨基酸分析：§2、蛋白質氨基酸的組成分析首先將蛋白質水解成游離氨基酸，再通過氨基酸自動分析儀分析蛋白質的氨基酸組成。

一、蛋白質的水解1.HCl水解法：5.7MHCl，105-110oC密封水解24-72h。通過此法水解，Trp被破壞；Ser、Thr被緩慢分解，但通過測定不同水解時間的量，可倒推水解初期的量；Cys被氧化。所以先氧化成穩定的磺基丙氨酸后再水解；Gln和Asn酸水解時脫酰胺后全部變為Glu和Asp,水解時放出的NH3可用來測定Gln和Asn的總量；Met水解時被氧化為甲硫氨酸砜，損失20%，需要校正。

2.磺酸水解法：是非氧化性強酸，用于代替HCl。方法：4M甲基磺酸，0.2%β-吲哚基乙胺（水解劑）。此法操作比較復雜。3.酶水解法：比較溫和，專一性強，受水解的氨基酸不被破壞（如Trp、Asn、Gln）；缺點是蛋白不易徹底水解。

用氨基酸自動分析儀分離和測定各種氨基酸的含量。此類儀器屬于離子交換層析系統，柱的填充材料為磺酸型聚苯乙烯陽離子交換樹脂，在pH2時，全部氨基酸結合在樹脂上，提高pH和離子強度，可以將氨基酸一次洗脫下來，從而達到分離目的（酸性氨基酸先下來，堿性氨基酸最后下來）；洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應呈紫色，可在570nm比色測定。目前有多種型號的氨基酸自動分析儀，如日立835-50型氨基酸自動分析儀分析的圖譜為：二、氨基酸的分離與定量測定

測定每條多肽鏈的氨基酸組成三、特殊氨基酸的測定（一）色氨酸（Trp)由于酸水解Trp被破壞。常用方法有：紫外吸收法：由于TrpandTyr在280nm~290nm有吸收，所以可用完整的蛋白質進行Trp的測定。已知Trp的摩爾消光系數：288nm=4815；280nm=5690Tyr的摩爾消光系數:288nm=385;280nm=1280

Trp/Tyr=(A288×1280)-(A280×385)}/{(A280×4815)-(A288×5690)

由于Tyr氨基酸殘基數可以測得，所以用Trp/Tyr比值就可以推算出Trp的量。2.對-二甲基氨基苯甲醛法：

Trp強酸醛有色物質（590nm)（二）巰基測定

方法有：硫醇鹽法、烷基化法和比色法等，由于比色法簡便，被廣泛應用。1．5,5-二硫代雙（-2-硝基苯基酸）（也叫Ellman試劑）

5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid

）（DTNB）：2Pr-SHPr-S-S-Pr+（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2NCOOHHSNO22(CNT)（三）二硫鍵的測定

1.Ellman試劑法

（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2N（DTNB）COOHSNO2O2NSCOOH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+COOHHSNO2（CNT）Pr-S-S-Pr+COOHSNO2O2NSCOOHPr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2+Pr-SH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+（CNT）COOHHSNO2Pr-SHPr-S-S-PrCOOHSNO2O2NSCOOH2+++3Pr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2（CNT）總反應：Pr-S-S-COOHNO2堿--HN-CH-CO--CH2SCOOHSNO2--HN-C-CO--CH2+SCOOHHSNO2+（CNT）實際測定時，將蛋白質溶于2M硫氰酸胍和3mMEDTA中，先用DTNB試劑測定釋放的CNT數，然后再將這個溶液pH調到10.5，再測定CNT釋放的數量，二硫鍵的數目可用下列公式計算：二硫鍵的數目=（pH10.5后測得的CNT數）－2（pH10.5前測得的CNT數）2如果蛋白質沒有活潑的巰基，可加入含巰基的化合物：Cys,GSH,DTT（四）氨基的測定

測定蛋白質和肽中的氨基常用：

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）比色法：與伯胺定量反應，分光光度法測定。熒光胺法：§3末端氨基酸的測定一、N-末端氨基酸的測定主要為化學方法。共同特點是：在N端引入一個標記性基團，后分離、鑒定帶有這種基團的氨基酸衍生物。（一）二硝基氟苯法（DNFB）（一）二硝基氟苯法（DNFB）NO2O2NF+H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3（DNFB）HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3NO2O2NFHHN-CH-COOHR1RNO2O2NnH2N-CH-COOH+蛋白-二硝基氟苯衍生物（DNP-Protein）DNP-氨基酸（黃色）氨基酸混合物蛋白質

除DNP-Arg外，其它氨基酸生成的DNP-氨基酸都可用乙醚抽提出來，然后用雙向紙層析，用標準DNP-氨基酸比較，取下色斑，用1%NaHCO3洗脫，360nm波長比色進行定量。酸水解

（二）丹磺酰氯法（Dansyl-ClorDNS-Cl）Dansyl-Cl是一種熒光試劑，能專一地與N-端α-氨基反應，生成DNS-肽,經酸水解后得到DNS-氨基酸和其它游離氨基酸。（DNS-Cl）NCH3CH3SO2Cl+H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3蛋白質HClNCH3CH3SO2-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3（DNS-Protein）酸水解NCH3CH3SO2-HN-CH-COOHR1各種游離氨基酸（DNS-AA）DNS-AA在紫外線下有強烈熒光，靈敏度高，比二硝基氟苯高100倍，而且水解產物不需要提取，樣品可直接進行紙層析。此方法已被廣泛應用于N-端氨基酸分析。（三）異硫氰酸苯酯法（PITC）：此法是Edman1950提出的，也稱Edman降解法。最大優點是可以連續降解，所以成為蛋白質氨基酸序列測定的基本原理和方法。（見后）

常用肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析。多肽與肼在無水條件下加熱（100oC)，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與C-端氨基酸分離。二、C-末端氨基酸的測定H2N-NH2(肼）H2N-CH-CO-NH…………CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOHR1R(n-1)RnH2N-CH-CO-NHNH2+NH2-CH-CO-NHNH2+H2N-CH-COOHR1R(n-1)Rn§4肽鍵的專一性裂解和肽段的分離純化由于用Edman降解法測定氨基酸序列，一次只能連續降解數10個殘基。用手工方法最多能測20個氨基酸殘基。所以需要將大肽裂解成小肽，然后分別對其測序。裂解要求切點少，專一性強，收率高。裂解方法主要有：化學法和酶法裂解時，一般先將二硫鍵還原，并用烷化劑使其烷基化，從而不會重新氧化成二硫鍵。（一）蛋白質的化學裂解一、肽鏈的專一性裂解化學裂解的產物片段較大，適合在自動序列分析儀上測定，同時也利于肽段的吻合。1.溴化氰裂解：溴化氰能專一裂解蛋氨酸殘基羧基的肽鍵，產率達85%。….-NH－CH－C－NH－CH－CO-….CH2CH3CH2S‖O….-NH－CH－C－NH－CH－CO-….CH2CH3CH2S‖OCN+Br-CNBr－RRCH3-S-CN….-NH－CH－C=NH－CH－CO-….RCH2CH2O+….-NH－CH－C=OCH2CH2OH2ONH2－CH－CO-…..RN-端側肽高絲氨酸內酯C-端側肽用此法裂解Met-X肽時，X的性質可影響裂解速度，特別是含羥基的氨基酸會干擾反應，應加大溴化氰的濃度（500：1）；在酸性條件下，可引起其它肽鍵裂解，特別是Asp--Pro2.亞碘酰基苯甲酸裂解法：打開Trp-X的肽鍵。3.X-Cys鍵的裂解：常用兩種試劑：2-硝基5-硫氰苯甲酸（NTCB）和（2-甲基）-N-1-苯磺酰-N-（溴乙酰）醌二亞酰胺（Cyssor)4.羥胺裂解：裂解Asn-Gly肽鍵。5.Asp-Pro鍵的裂解：在稀酸溶液中就可斷裂。（二）蛋白質的酶法裂解優點：專一性好，不易破壞氨基酸。常用的酶：胰蛋白酶：Lys(Arg)—X胰凝乳蛋白酶：專一性較寬，但對疏水AA—X

裂解好胃蛋白酶：芳香AA（Leu)—X

二、肽段的分離純化及純度鑒定（一）分離純化根據肽段的大小、電荷、極性、溶解度等不同可以選擇：凝膠過濾、離子交換、薄曾層析、毛細管電泳等但現在常用高壓液相色譜法（HPLC）。（二）純度鑒定樣品中只有一條肽。N-端氨基酸分析只有一種氨基酸為純品§5肽段的序列測定一、手工序列測定技術：化學法和酶法（一）Edman化學降解法此法比較有效，是最基本的方法。所用試劑是異硫氰酸苯酯（PITC）H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3N=C=S異硫氰酸苯酯（PITC）（肽）在堿性（pH9-9.5）下進行偶聯反應-H

N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3N-C‖S異硫氰酸苯酯肽（PTC-肽）NH-CCSNHCH-R1=ONH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R2R3+2-苯胺基-5-噻唑啉酮衍生物（PTZ）在強酸條件下裂解

在HCl,80oC下轉化NCCSNHCH-R1=‖O3-苯基-2-乙內酰脲（PTH-AA）進行下一輪循環反應上述反應得到的PTH-AA穩定，可用薄層層析、氣相色譜、回水解法（即用酸水解PTH-AA，將其中的氨基酸釋放出來，再用氨基酸分析儀測定），即得到氨基酸序列的第一個殘基。裂解步驟產生的少了一個AA殘基的肽可以進行下一輪循環，這樣可以得到第二個、第三個……….等氨基酸。（二）DNS-Edman法

是Edman的改良方法。靈敏度較高，但酰胺和Trp不易檢出。（三）酶降解法

利用外肽酶1.氨肽酶法2.羧肽酶法

羧肽酶A:釋放除Pro,Arg,Lys外所有C-端氨基酸殘基（牛胰臟）．

羧肽酶B：只釋放Arg,Lys堿性氨基酸C-端氨基酸殘基（豬胰臟）．羧肽酶Y：20種氨基酸全釋放（面包酵母）二、自動序列分析為減輕手工測序的煩瑣勞動，提高每次循環的收率，基于Edman反應原理，人們研制了氨基酸序列分析儀。有三類序列儀：液相、固相和氣相。§6由已知序列的肽段建立蛋白質一級結構一、重疊肽（接頭肽）

用至少兩套切肽鏈的方法，得到兩套以上的肽段及其各肽段的氨基酸排列順序，然后根據兩套肽段的重疊區域，就可以查出蛋白質的整個氨基酸排列順序。二、二硫鍵位置的確定在測定一級結構時，肽鏈二硫鍵都是用烷化劑保護的。在測出一級結構后，需要確定哪幾個Cys形成二硫鍵。方法：直接用蛋白酶（內切酶）水解原來的蛋白質，保留二硫鍵的完整性，然后找出含二硫鍵的肽（用對角線電泳法），再將這個肽的二硫鍵拆開，分別測定兩個肽的序列，將這兩個肽段的序列與原來的一級結構對比，就可以找出相應的二硫鍵的位置。對角線電泳法：用蛋白酶水解原來的蛋白，得到一系列肽段（包括含二硫鍵的肽段）后，先進性第一向電泳，將產物分開；再用還原劑（碘乙酸等）處理，將二硫鍵打開，在進行第二向電泳，電泳條件與第一向完全相同。選取偏離對角線的樣品(多肽或寡肽），即為含二硫鍵的肽。如果二硫鍵在一條肽鏈內存在，而且在該肽鏈中另有一個Cys,則應該在未拆開二硫鍵之前，將14C-碘乙酰胺封閉，二硫鍵不參與此反應，這樣可以確定哪兩個Cys參與二硫鍵的形成。如果一條鏈有兩個二硫鍵，常常用兩個酶酶切得到含二硫鍵的肽。三、酰胺基位置的確定在測定蛋白質基團時，如果測出有酰胺基的存在，就要在測序后確定酰胺的位置。即確定第幾位的Asp或Glu是酰胺化的。確定方法有三種(略)第三章蛋白質的修飾

蛋白質修飾的概念比較廣，廣義上講，凡是肽鏈在體內合成后經過的體內或體外的一系列變化都成為蛋白質修飾。我們要介紹的是體外的蛋白質修飾。主要包括：

化學修飾:包括蛋白質側鏈修飾和蛋白質肽鏈膠聯熒光標記酶標記生物素標記放射性標記親和標記其它§1影響蛋白質化學修飾的主要因素一、影響蛋白功能基反應性的因素主要包括蛋白功能基的反應性和修飾劑的反應性

蛋白質氨基酸分布情況是：中間核心是疏水aa，表面是親水性aa。分子表面的特點不僅影響功能基的理化特性，也影響化學試劑的接近。所以要考慮微區對功能基反應性的影響。

微區的極性和空間位阻是影響功能基反應性的重要因素。功能基反應性較復雜。如：某些側鏈基團與個別試劑反應性非常強，叫功能基的超反應性。影響超反應性的因素很復雜如：pK值功能基的親和性靜電吸附使試劑正確取向微區主體化學的適應性試劑結合一、影響修飾劑反應性的因素1選擇吸附：2靜電相互作用：帶電的修飾劑易與蛋白質表面相反電荷的部位的基團反應。3位阻因素：4催化因素：局部功能基有時起酸堿催化作用，影響修飾作用。5局部極性：§2蛋白質化學修飾的方法修飾劑和修飾條件是影響修飾專一性的主要因素。一、修飾專一性的控制

1.試劑的選擇：

修飾基團和修飾目的不同，所用的試劑是不同的。例如：（1）修飾所有氨基、修飾暴露的氨基、修飾具有催化活性的氨基，目的不同應選用不同的條件；(2)改變蛋白質帶電狀態：引入大電荷量的試劑；（3）修飾后利于蛋白質定量：引入光吸收試劑等等。選擇修飾劑要考慮的問題:(1)修飾程度；(2)專一性；(3)反應限度；(4)修飾后構象變化（應該不變或少變)；(5)反應需要可逆性；(6)分析方法建立情況等。2.反應條件的選擇：

不造成蛋白質不可逆變性（溫度、pH、介質、離子活性高)；(2)有利于專一性修飾3.反應的專一性：

反應專一性非常重要。控制方法：利用被修飾蛋白活性部位的特殊結構（空間結構）影響某些基團的活性。如：二異丙基氟磷酸酯（DFP）能與胰蛋白酶活性絲氨酸作用，導致酶迅速失活，但在同樣條件下不能使其它酶，如胰凝乳蛋白酶作用，這就是“位置專一性”。選擇不同的pH影響功能基的解離，使其利于修飾。親和標記（有特殊的親和力）是實現專一性修飾的重要途徑。試劑結構常與蛋白（如酶）的底物或抑制物相類似。在作用前，試劑先與蛋白活性部位非共價結合，然后再發生化學作用進行共價連接，將試劑掛到活性部位的基團上。這種方法在研究酶活性部位上特別有用。如用對甲基苯磺酰氯能夠作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上。(4)差別標記：在底物或抑制劑存在下進行化學修飾時，由于它保護著蛋白活性部位基團，使這些基團不能與試劑作用，只有活性部位以外的基團有可能被修飾。然后將底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白再與含同位素標記的同樣試劑作用，結果只有原來被底物或抑制劑保護的基團是帶有放射性同位素標記的。用這一方法可直接得到蛋白質的活性基團。§3蛋白質側鏈修飾一、氨基的修飾（主要是賴氨酸的ε-NH2）可分為三類：引入正電荷修飾；電荷消失修飾；引入負電荷修飾。1.引入正電荷的修飾：甲基乙亞酰胺脒

Pr－NH2H2NCR’OR+=R’OHPr－NH-C-R

=++H2N+2消除電荷修飾：抑制賴氨酸的ε—NH2質子化如：乙酰化、甲氨酰化和芳基化。Pr－NH2+H2SO3OCOCO－CH3‖pH>7C－CH3O－CH3Pr－NH+CH3COOH乙酸酐Pr－NH2+H2NCOPr－NH-CO-NH2甲酰胺三硝基苯磺酸（TNBS）O2NSO3HNO2NO2Pr－NH2+O2NNH－PrNO2NO2+黃色物質，367nm，用于定量測定蛋白質的氨基量3引入負電荷的修飾：包括乙酰化和磷酸吡哆醛修飾Pr－NH2+OCOC－CH2O－CH2pH>7Pr－NH-CO-CH2-CH2-COOHPr－NH2+NCH2-O-PHHOH3CCHONaBH4NCH2-O-PHHOH3CCH2-NH-PrNPHHOH3CC=N-PrCH2-O-二、精氨酸胍基的修飾CH3-CO-CO-CH3，CO-CO-CH3H-CO-CO-H具有兩個相鄰位羰基的化合物能與精氨酸胍基形成穩定的雜環產物。常用試劑：丁二酮、苯乙二醛、乙二醛。2H2OPr-NH-CNNRN=C=NH-R’CHCHOO==CHCHPr-NH-C‖‖NHNH三、羧基的修飾：試劑有碳二亞胺‖‖

Pr-COONR’-C-NHR

OH‖

Pr-CORN=C=NH-R’==四、巰基的修飾：蛋白質的巰基很活潑，很多試劑可以與其反應，有三類試劑：1碘乙酸，碘乙碘胺等。2馬來酰亞胺或馬來酸酐3有機汞試劑，如：對氯汞苯甲酸1類試劑屬于烷化劑。產物相當穩定，易于分析，目前已經開發出很多帶有熒光的碘乙酸衍生物。它們也能與Met、Lys、His反應。2類試劑能與巰基形成對酸穩定的衍生物。N—乙基馬來亞胺，反映專一性強，產物在300nm處有吸收峰。3類試劑對巰基專一性最強。常用對氯汞苯甲酸，產物在280nm吸收峰1.Pr-SHICH2COOH2.Pr-SH+3.Pr-SHpH>7Pr-S-CH2-COOH+N-CH2-CH3=O=OpH>5Pr-SN-CH2-CH3=O=O+HCl-COOHCl-Hg-Pr-S--COOHHg-五、組氨酸咪唑基的修飾：常用試劑：焦碳酸二乙酯和碘乙酸CH3-CH2-OH+CO2Pr-CH2

HNHNICH2COOH+Pr-CH2

N-CH2-COOHNCH2-COOH+Pr-CH2

HNHN+=OOC-O-CH2-CH3C-O-CH2-CH3==OOPr-CH2

HN-C-OCH2-CH3N產物在240nm處有最大吸收，可用光譜追蹤反應和定量測定碘乙酸

焦碳酸二乙酯六、色氨酸吲哚基的修飾：1.N—溴琥珀酰亞胺（NBS）2.2—羥—5—硝基芐基溴九、絲氨酸羥基的修飾：甲苯磺酰氯（PMSF）七、酪氨酸酚羥基的修飾：四硝基甲烷（C(NO2)4)八、甲硫氨酸甲硫基的修飾：碘乙酸等常用主要修飾劑的專一性試劑醋酸酐酰基酸酐修飾側鏈醛四硝基甲烷N-溴琥珀酰亞胺碳二亞胺苯異硫氰三硝基苯磺酸焦碳酸二乙酯碘乙酸環乙烯亞胺苯甲磺酰氯LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet×××××××××××××××××××××××××××××××××馬來酰胺§4蛋白質肽鏈交聯有些試劑具有兩個功能基團或反應部位。可以使兩個相隔較近的氨基酸殘基間進行搭橋，從而形成多肽鏈或多肽間的交聯，而不引起蛋白質構象的重大變化。這種試劑稱為雙功能試劑。這一技術常用于蛋白質構象和蛋白質間相互作用的研究。、設計或選擇交聯劑要考慮的因素1.反應的專一性現在大多數交聯劑能與蛋白質氨基或巰基反應。根據反應類型，交聯劑分兩類：同型雙功能試劑Pr—NH2?H2N—Pr；Pr–SH?HS—Pr異型雙功能試劑Pr—NH2?HS—Pr2.交聯距離交聯距離是一個重要參數。隨著交聯劑兩個功能基之間距離跨度的增加，形成交聯的可能性也隨之增加。用一系列具有類似專一性，但跨度不同的交聯劑，可獲得關于基團空間方位的大量信息。肽鏈間進行交聯時，必須使用跨度最短的交聯劑，否則得不到肽鏈間的交聯。3.可裂解性研制可裂解的交聯劑有助于分離交聯片段。在這種交聯劑的兩個功能基之間，含有交聯后可在溫和條件下被裂解的區域。利用這一特點，結合雙向電泳，可以很容易地分離和分析交聯的組分。可裂解型不可裂解型二、交聯劑的類型同型雙功能試劑異型雙功能試劑可被光激活試劑反應基團反應基團間隔基團同型雙功能基團-(CH2)n-;非裂解CH3-O-C-=NH2+CH3-O-C-=NH2+-(CH2)n-

S-S-(CH2)n-;可裂解異型雙功能基團CH3-O-C-=NH2+與氨基反應與氨基反應-S-S-N與巰基反應-(CH2)n-;非裂解=OOH(-CH-C-)2可裂解光活化雙功能基團N3OH-(CH2)n-;非裂解=OOH(-CH-C-)2可裂解-S-S-NCH3-O-C-=NH2+光照活化，但沒有專一性1研究蛋白質的折疊2分子間的交聯，穩定蛋白質3測定蛋白質亞基的數量（SDS—PAGE）4其它三、交聯劑的應用親和標記又稱部位專一性標記，專一性強，是一種特異的化學修飾方法。他是利用酶與底物的親和性，使用與酶底物類似的修飾劑，對酶活性部位上的氨基酸殘基進行共價標記。由于這類的試劑對蛋白質某些特殊部位有親和性，所以成為“親合試劑”親合試劑分為：內生親和試劑:試劑本身某部分通過化學方法轉化為所需反應基團外生親和試劑:試劑+反應中的基團→外生親和試劑一、內生親和試劑如ATP是許多酶的底物，用過碘酸氧化ATP，核糖部分的2，3－鍵打開，形成含二醛的ATP衍生物。

§5親和標記O15432OHOHCH2NNNH2

NNH123456789OAdenosine-5-monophosphate(ATP)PPPHIO4O15432CHOCHOCH2NNNH2

NNH123456789O(O-ATP)PPPO-ATP的兩個醛基與酶的氨基或巰基作用形成烯夫堿，通過NaBH4還原后，產生不可逆的失活酶，用硼氚化物還原烯夫堿，則得氚標記衍生物。另外ATP,ADP,GTP,NADP都可制成二醛化合物。將鹵代烷衍生物連于腺嘌呤N6上生成外生親和試劑二、外生親和試劑：O15432OHOHCH2NNNH-CH2--NH-CO-CH2-Br

NNH123456789O

N-6-對-溴乙酰胺-芐基-ADPPP-COOHCl-Hg-測定蛋白質中某種氨基酸的數量。2.在蛋白質序列分析中的應用

3.在研究蛋白質立體結構中的應用

?確定某些基團在蛋白質中的位置：表面的氨基酸基團易與試劑作用，而埋藏在里面的氨基酸基團不易與試劑作用。

?測定蛋白質分子中特定基團的距離。這可通過雙功能試劑對多肽鏈交聯來實現。

?研究蛋白質溶液的構象：由于側鏈的反應性是由其所處環境控制的，反過來講，反應性反映了基團所處的環境。4.確定氨基酸殘基的功能。5.在蛋白質免疫化學研究中的應用

?放射免疫測定：用放射性同位素標記抗原或抗體，用以檢測抗體或抗原。如用同位素I標記蛋白質分子中的Try側鏈。

§6蛋白質化學修飾的應用主要是在酶工程方面的應用：?提高酶的穩定性（如:固定化技術）?改變酶的專一性如木瓜蛋白酶經過黃素溴酰衍生物處理產生具有氧化還原酶活性的黃素木瓜蛋白酶?創造新的酶活性:6.在生物工程中的應用?酶標免疫測定：用戊二醛將酶與抗體結合，標記后的酶標抗體具有結合抗原的活性和酶的活性，酶催化效率高，有放大信號的作用。有關酶和抗體的標記下一節專門介紹。抗體(IgG)標記可采用酶、熒光染料、生物素、及有色金屬金。一、酶標記常用的酶有：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）和半乳糖苷酶（Lac）。酶標抗體已廣泛應用于：ELISA,Western-blot（蛋白免疫印跡），細胞與組織免疫化學的免疫染色過程。1.辣根過氧化物酶（HRP）標記:過碘酸鹽法HRP是糖蛋白在NaIO4作用下，將糖鏈中的羥基氧化成醛或羧基，生成的醛可以與抗體的氨基結合，形成希夫堿，再用NaBH4還原成穩定的“酶—抗體復合物”。§7抗體標記實例1.AP標記：戊二醛法AP與IgG偶聯可通過戊二醛一步交聯法來完成，效果較好。半乳糖苷酶可用戊二醛一步法或間位—馬來酰亞胺苯—N—羥基琥珀酰亞胺酯（MBS）偶聯法來交聯。HRP與抗磷酸酪氨酸抗體偶聯：Amersham公司提供用熒光染料標記抗體（或蛋白）后，可以發出特定波長的光。這樣可直接地觀察抗原和抗體的反應。這是細胞和組織化學免疫染色、熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀分析等過程的基礎。常用的熒光染料有：熒光素（fluorescien）、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明等。下面介紹：二、熒光染料標記1.異硫氰酸鹽衍生物：異硫氰酸熒光素（fluorescienisothiocyanatcFITC）羅丹明異硫氰酸鹽(rhodamineisotholyanale)四甲基羅丹明異硫氰酸(tetramethyrhtdamineTRITC)方法：A.制備lg容量的凝膠粒、凝膠排阻上限為20000~50000，直徑約為50μm,用PBS平衡。B.用0.1M碳酸鈉（pH9.0）,配制大約2mg/mlIgG溶液。C.取1mgFITC或者TRITC溶于1ml無水高純度二甲基砜中（用前配置），取50μl，在攪拌下分10次緩慢加入到1ml的IgG溶液中，將其放暗處8h(4℃)D.加入NH4Cl至50mM,8h(4℃),再加二甲苯蘭至0.1%和甘油5%。E.用凝膠過柱分離標記和未標記的抗體。(先脫下的第一個峰為標記的，再脫洗液中加入0.02%疊氮吶和1%BSA,4℃避光保存。三、生物素標記蛋白質（酶或抗體）與小分子生物素偶聯后，并不會改變生物活性，反而可提高檢測靈敏度。近幾年來生物素—抗生物素蛋白（親和素）系統已經成為一種很有效的檢測系統。將親和素（抗生物素蛋白）用酶標記后，再與生物素—IgG復合物結合，可大大提高靈敏度。廣泛用于ELISA,免疫印跡，組織免疫化學流式細胞儀。如：生物素標記抗體：許多生物素是先制備成生物素琥珀酰亞胺酯（SuccinimideecterofGiotin）(可直接買)然后用于標記。

?取10mgN—羥基琥珀酰亞胺—生物素，溶于1ml二甲亞砜（DMSO）中。?取1~3mgIgG溶于1ml0.1M硼酸鈉Buffer(pH8.8)。如果IgG中已加了NaN3時，則必須用透析法將其除去。?按照25~250μg生物素衍生物對1mgIgG比例混合，混勻，置室溫4h(全部抗體可被高濃度的生物素標記)。?加1MNH4Cl(250μg生物素需此液20μl)到上述反應液中，室溫10min。?用PBS透析，以除去游離的生物素，透析48h，生物素標記的抗體可保存于-20℃。蛋白質測序的重要方法N-末端測定二硝基氟苯（DNFB）法：肽游離末端NH2與DNFB反應生成DNP-肽，最后水解生成黃色DNP-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯異硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，從肽上斷裂下來氨肽酶法：外切酶，但效果不好C-末端測定肼解法：測定C-末端的最重要的化學方法，肽與肼反應，除C-末端氨基酸游離外，其他氨基酸轉變為氨基酸酰肼化物還原法：C-末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應的α-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶C羧肽酶Y二硫鍵的斷裂過甲酸氧化法：將二硫鍵氧化成磺酸基巰基化合物還原法：將二硫鍵還原成巰基，然后用烷基化試劑如碘乙酸保護巰基，防止其重新被氧化氨基酸組成的測定：酸水解：是主要方法，多用HCl，同時輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破壞，Ser，Thr，Tyr部分破壞，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu；多肽鏈的裂解酶裂解：胰蛋白酶：專一性強，斷裂Lys或Arg的羧基參與形成的肽鍵糜蛋白酶：斷裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基端肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性差，斷裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基參與形成的肽鍵胃蛋白酶：在酸性條件穩定，肽鍵兩側均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時，常用到此酶。其它酶：略化學裂解：溴化氰（CNBr）：只斷裂Met的羧基形成的肽鍵羥氨（NH2OH）：在pH9時，專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，其它條件下不專一肽段的氨基酸測序Edman化學降解法：用Edman試劑PITC與游離氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各種層析技術分離；用此法降解，一次可連續測出60-70個氨基酸殘基的序列；工作量大，操作麻煩；現改用蛋白質測序儀。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困難質譜法：質譜儀由核苷酸序列推定法：mRNAcDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推測出蛋白質的氨基酸序列肽段在肽鏈中次序的確定：需借助重疊肽。

重疊肽：由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同，產生的切口彼此錯位，使兩套肽段正好跨過切口而重疊的肽段；獲得重疊肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品，得到兩套或多套肽段。二硫鍵位置的確定：一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質。一是胃蛋白酶專一低，切點多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定；二是在酸性條件下，有利于防止二硫鍵發生交換反應。蛋白質的氨基酸序列與生物功能；肽合成同源蛋白質：在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質稱同源蛋白質。同源蛋白質具有共同的進化起源。同源蛋白質具有明顯的氨基酸序列相似性，稱之為序列同源。根據同源蛋白質的氨基酸序列資料可建立系統樹（進化樹）。兩個物種的同源蛋白質，其序列中氨基酸的差異數目與這些物種間的進化發生差異是成比例的。蛋白質激活：在生物體內有些蛋白質是以前體形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性，稱之為蛋白質激活。如酶原激活。肽的人工合成：氨基酸共聚合（由一種或兩種氨基酸反應）控制合成（由不同氨基酸按一定順序）：接肽反應需接肽試劑，為避免接肽試劑與某些活潑基團反應，故在接肽前須首先將這些基團加以封閉或保護，如氨基保護或羧基保護等。在正常條件下，羧基和氨基之間不會自發形成肽鍵，即氨基或羧基需活化，通常是羧基活化。固相肽合成：是控制合成技術的巨大進步，利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質。其實質是肽的羧基端第一個氨基酸共價掛接在樹脂上，然后加入氨基受保護的第二個氨基酸并發生縮合反應，形成肽鍵，依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護基團。Ⅲ蛋白質的三維結構研究蛋白質構象的方法：至今研究蛋白質三維結構的成就主要是應用間接的X-射線衍射法；研究溶液中蛋白質構象的光譜學方法（了解）。穩定蛋白質三維結構的作用力非共價鍵（次級鍵）氫鍵范德華力疏水作用：突出地位離子鍵（鹽鍵、靜電引力）共價鍵：二硫鍵，重要作用蛋白質的二級結構無規卷曲

β轉角β折疊片α螺旋：最常見、最典型、最豐富的二級結構元件α螺旋：是重復性結構，每圈螺旋站3.6個氨基酸殘基，沿螺旋軸上升0.54nm，即螺距值；由氫鍵封閉的環為13元環；一般為右手螺旋；分子內或鏈內氫鍵使之穩定，減少R基間的相互作用或β-碳原子無分支結構均利于其穩定，而Pro存在可中斷之。非重復性結構β折疊片：為重復性結構；β折疊片的肽鏈處于曲折的伸展狀態；借助鏈間或肽段間的氫鍵而穩定；分為平行和反平行β折疊片，平行的比反平行的更規則。纖維狀蛋白質：動物體的基本支架和外保護成分，分子具規則的線性結構。纖維狀蛋白質不溶性（硬蛋白）可溶性蛋白角蛋白膠原蛋白：結締組織中（骨、皮膚等）大量存在彈性蛋白：存在于結締組織α角蛋白：主要存在于毛發中β角蛋白：天然存在于絲中其它肌球蛋白血纖蛋白原其它說明：

α角蛋白經充分伸展后可轉變成β角蛋白，即β折疊片結構。球狀蛋白質：

其種類遠比纖維狀蛋白質多，蛋白質結構的復雜性和功能的多樣性主要體現在球狀蛋白質；球狀蛋白質的整個肽鏈沒有均一的二級結構，但具有多種二級結構元件如α螺旋、β折疊片、無規卷曲等，由此構建的三級結構—結構域，并將球狀蛋白質分成4大類；其三維結構具有明顯的折疊層次，且疏水測鏈球狀分子內部，親水側鏈暴露在分子表面；在多數的胞內酶、血漿蛋白及蛋白類激素都屬于球狀蛋白質。超二級結構：由若干相鄰的二級結構元件組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多，有規則的二級結構串，并在多種蛋白質中充當三級結構的構件，稱為超二級結構。已知有3種基本形式：αα、βαβ、ββ。結構域：在多肽鏈上由二級結構元件或超二級結構形成的相對獨立的緊密球狀實體，是三級結構的局部折疊區。較小的球狀蛋白質或亞基是單結構域，而較大的球狀蛋白質或亞基是多結構域。結構域可分4類：全α結構、α，β結構、全β結構和富含金屬或二硫鍵結構域。蛋白質變性與蛋白質折疊蛋白質變性：天然蛋白質分子在受到理化因素的作用時導致溶解度降低、不對稱性增高、生物活性喪失及理化特性改變，此過程稱之為蛋白質變性。蛋白質變性的實質是分子中次級鍵被破壞，引起天然構象解體。變性不涉及